基于滾環(huán)DNA擴(kuò)增和納米材料的生物傳感分析方法研究.pdf

1、隨著分析科學(xué)的不斷發(fā)展，生命科學(xué)領(lǐng)域中蛋白質(zhì)、核酸、酶活性以及生物小分子的相關(guān)信息越來越多地需要借助于生物傳感技術(shù)進(jìn)行分析和檢測(cè)取得?？焖?，準(zhǔn)確的獲取這些生命分子的信息對(duì)生物醫(yī)學(xué)，臨床診斷和治療具有非常巨大的意義。近年來，新的分子生物技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用中得到不斷的發(fā)展和完善。然而，隨著醫(yī)學(xué)診斷水平的不斷提高和科學(xué)研究的持續(xù)深入，對(duì)生物分子檢測(cè)方法的要求也越來越高。開發(fā)一些高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確性、低成本、簡(jiǎn)單快速的

2、定性或定量的分析方法以更好的滿足研究和實(shí)際應(yīng)用的需要成為分析化學(xué)科研工作者面臨的重大挑戰(zhàn)。本論文針對(duì)上述問題，基于滾環(huán)DNA擴(kuò)增技術(shù)和新型納米材料發(fā)展了一系列高靈敏度、高特異性的生物分析方法用于酶活性、核酸、蛋白以及小分子檢測(cè)，并進(jìn)一步通過對(duì)實(shí)際樣品的分析，初步驗(yàn)證了這些技術(shù)的可行性、可靠性以及準(zhǔn)確性。具體內(nèi)容如下:
　　人鳥嘌呤糖基化酶(hOGG1)由于具有修復(fù)DNA氧化損傷的能力而在維持生命體基因完整度上發(fā)揮著重要作用。hOG

3、G1的表達(dá)水平與很多包括癌癥在內(nèi)的疾病緊密相關(guān)。在第2章中，我們構(gòu)建了一種新穎的熒光“l(fā)ight-up”型的生物傳感器用于高靈敏檢測(cè)hOGG1活性。該方法的建立基于目標(biāo)物誘導(dǎo)形成5'端磷酸化探針和能夠產(chǎn)生自催化DNA酶的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)。該方法對(duì)hOGG1的檢測(cè)限可低至0.001 U/mL，如此低的靈敏度主要?dú)w因于基本沒有增加的背景信號(hào)和我們構(gòu)建的雙信號(hào)放大策略。據(jù)我們所知，這是檢測(cè)堿基修復(fù)酶的方法中最靈敏的檢測(cè)方法之一。同時(shí)，該方法對(duì)可能

4、影響目標(biāo)物檢測(cè)的干擾酶體現(xiàn)出很好的特異性，在實(shí)際樣品的分析中有很大的應(yīng)用潛力。
　　單核苷酸多態(tài)性，是指基因組水平上單個(gè)核苷酸的變異，是最常見的遺傳變異類型。如果突變發(fā)生在遺傳基因的編碼區(qū)，可能會(huì)引起所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能的改變，從而引起基因疾病的發(fā)生。發(fā)展高靈敏，高特異性的檢測(cè)方法用于單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)對(duì)產(chǎn)前基因診斷具有重要意義。在第3章中，我們利用EcoliDNA連接酶對(duì)單堿基錯(cuò)配的高特異性識(shí)別能力，結(jié)合上一章的滾環(huán)擴(kuò)增技

5、術(shù)和DNA酶循環(huán)放大技術(shù)構(gòu)建了一種高靈敏和高特異性檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性的分析方法。掛鎖探針只能與完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA雜交后才能被Ecoli DNA連接酶連接成環(huán)，并引發(fā)級(jí)聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)。錯(cuò)配的DNA與掛鎖探針不能發(fā)生完全雜交，EcoliDNA連接酶能夠識(shí)別不完全雜交的探針，因此，掛鎖探針不能連接成環(huán)形探針，進(jìn)而沒有級(jí)聯(lián)信號(hào)放大反應(yīng)的發(fā)生，檢測(cè)不到熒光信號(hào)。該分析方法對(duì)單核苷酸多態(tài)性具有很好的檢測(cè)性能，對(duì)目標(biāo)DNA檢測(cè)的線性范圍為0.01-

6、1 nM，檢測(cè)下限為2.6 pM。此外，由于DNA連接酶在連接位點(diǎn)對(duì)單堿基錯(cuò)配的識(shí)別能力，該方法在野生型和突變型以不同比例混合的樣品中對(duì)突變型的DNA具有很好的特異性。
　　核酸內(nèi)切酶Ⅳ(EndoⅣ)，作為一種DNA修復(fù)酶，主要修復(fù)由脫堿基位點(diǎn)造成的DNA損傷，因此，在維持基因完整度方面發(fā)揮著重要作用。在第4章中，我們證明了EndoⅣ對(duì)單鏈DNA(sDNA)中脫嘌呤/脫嘧啶位點(diǎn)(AP)的裂解能力。我們發(fā)現(xiàn)，EndoⅣ對(duì)ssDNA中

7、的AP位點(diǎn)有很好的裂解能力相比于對(duì)雙鏈DNA中AP位點(diǎn)的酶切活性。進(jìn)一步地，我們利用EndoⅣ裂解ssDNA中AP位點(diǎn)性質(zhì)構(gòu)建了一種雙信號(hào)放大體系用于高靈敏檢測(cè)酶和蛋白的活性。雙信號(hào)放大體系主要是將核酸外切酶Ⅲ(ExoⅢ)輔助的信號(hào)放大方法和滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來。通過這樣的放大體系，我們構(gòu)建的分析方法具有良好的分析性能，對(duì)EndoⅣ的檢測(cè)下限可達(dá)0.008 U/mL，對(duì)鏈霉親和素(SA)的檢測(cè)下限可達(dá)2.5 pM。此外，該方法對(duì)其他可能

8、會(huì)有干擾的物質(zhì)表現(xiàn)出良好的特異性。本章提供了一種新的可用于酶和蛋白檢測(cè)的平臺(tái)，并有潛力在生物分析、疾病診斷和藥物發(fā)展方面找到更廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
　　乙酰膽堿酯酶，是動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中很重要的一種關(guān)鍵酶，在阿茲海默疾病、炎癥和神經(jīng)毒性方面發(fā)揮著重要的功能。乙酰膽堿酯酶通過將乙酰膽堿水解成膽堿以維持神經(jīng)遞質(zhì)的水平。而乙酰膽堿酯酶的抑制劑，能夠使乙酰膽堿保持活躍狀態(tài)，并在體內(nèi)積累造成致命的后果。因此，測(cè)定乙酰膽堿酯酶活性和篩選其抑制劑具

9、有重大意義。在第5章中，利用聚T-DNA為模板合成的熒光銅納米顆粒，我們構(gòu)建了一種簡(jiǎn)捷、高靈敏、高特異性的熒光分析方法用于乙酰膽堿酯酶及其抑制劑的檢測(cè)。該檢測(cè)方法利用硫代乙酰膽堿做為乙酰膽堿酯酶的底物，在乙酰膽堿酯酶的水解作用下，硫代乙酰膽堿被水解成硫代膽堿，硫代膽堿的自由的巰基可以和銅納米顆粒發(fā)生配位作用，進(jìn)而猝滅銅納米顆粒的熒光。該傳感器具有較好的分析性能，對(duì)乙酰膽堿酯酶的檢測(cè)范圍為0-5 mU/mL，檢測(cè)下限達(dá)0.026mU/mL

10、，并且對(duì)其他可能會(huì)干擾檢測(cè)的蛋白具有很好的特異性。此外，我們還用該傳感器進(jìn)行了乙酰膽堿酯酶抑制劑的檢測(cè)，有機(jī)磷殺蟲劑對(duì)氧磷為被選作抑制劑的模型進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)機(jī)理主要是利用有機(jī)磷可以抑制乙酰膽堿酯酶對(duì)硫代乙酰膽堿的水解，進(jìn)而沒有硫代膽堿產(chǎn)物的生成，銅納米顆粒的熒光不會(huì)被猝滅。通過銅納米顆粒的熒光強(qiáng)度恢復(fù)信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)有機(jī)磷的檢測(cè)。該傳感器對(duì)對(duì)氧磷的檢測(cè)IC50值約為84 pg/mL。而且，我們還用該方法對(duì)實(shí)際樣品中加入的對(duì)氧磷進(jìn)行了檢測(cè)，獲得

11、了滿意的結(jié)果。本章的工作可能提供了一種在生物醫(yī)學(xué)和臨床應(yīng)用方面具有潛力的可用于酶及其抑制劑的分析傳感平臺(tái)。
　　目前，熒光納米顆粒由于其在標(biāo)記、傳感器、成像和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的前景受到了越來越多的關(guān)注。在第6章中，我們利用二氧化錳作為氧化劑用于合成熒光聚多巴胺納米顆粒。二氧化錳存在時(shí)，可以快速將多巴胺氧化成多巴醌，緊接著多巴醌通過自發(fā)聚合反應(yīng)形成熒光聚多巴胺納米顆粒。進(jìn)一步，利用熒光聚多巴胺納米顆粒作為指示劑，構(gòu)建了一種低成本、快