糖基工程酵母表達(dá)重組人凝血酶原2和丁酰膽堿酯酶的研究.pdf

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：繳當(dāng) 簽字日期：z p ／b 年砌2 鄉(xiāng)日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解安徽大學(xué)有關(guān)保留、

2、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。( 保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū))學(xué)位論文作者簽名： 頭孝 導(dǎo)師簽名：簽字日期：矽珀年籮月z 6 日 簽字目期： ≯擴(kuò)形年堂月z 6 日糖基工程酵母表達(dá)重組人凝血酶原2 和丁酰膽堿酯酶的研究胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)的兩種

3、形式，均未獲得有活性的E c a r i n ，W e s t e r nB l o t 也未檢測(cè)到特異性條帶。哺乳動(dòng)物2 9 3 T 細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)E c a r i n ，收集培養(yǎng)上清，加入2 9 3 T 細(xì)胞表達(dá)的E c a r i n 培養(yǎng)上清的凝血酶原2 ，將S - 2 2 3 8 ( H —D —P h e ．P i p —A r g —p N A ·2 H C I ) 降解為p N A ，產(chǎn)生淡黃色顏色反應(yīng)；未加E

4、 c a r i n 培養(yǎng)上清的的凝血酶原2 與S - 2 2 3 8 沒(méi)有顏色變化，表明哺乳動(dòng)物2 9 3 T 細(xì)胞表達(dá)的E c a r i n 可以將糖基工程酵母表達(dá)的凝血酶原2 活化為有活性的凝血酶。3 ．凝血酶原．2 的活性研究利用發(fā)色底物吸光值的變化測(cè)E c a r i n 活化凝血酶原2 的劑量關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)純化的凝血酶原2 的量不變時(shí)，隨著2 9 3 T 表達(dá)E c a r i n 培養(yǎng)上清的增加，S - 2 2 3 8 被

5、降解產(chǎn)生的吸光值也相應(yīng)的增加，說(shuō)E I f J E c a r i n 對(duì)p r e t h r o m b i n ．2 的活化具有劑量依賴(lài)性。純化的凝血酶原2 經(jīng)E c a r i n 活化后，可以促進(jìn)小鼠血漿發(fā)生凝集，凝血時(shí)間為1 6 s ；以T T 試劑盒中的凝血酶作為陽(yáng)性對(duì)照，它與血漿反應(yīng)的凝血時(shí)間為2 7 s ，說(shuō)明凝血酶原2 活化后具有血凝活性。4 ．野生型酵母表達(dá)不同形式的丁酰膽堿酯酶本實(shí)驗(yàn)利用糖基工程酵母表達(dá)制備重組人

6、丁酰膽堿酯酶。在野生型酵母X 3 3中表達(dá)不同結(jié)構(gòu)的丁酰膽堿酯酶，比較不同結(jié)構(gòu)的丁酰膽堿酯酶的表達(dá)量和活性差異，選取長(zhǎng)效的丁酰膽堿酯酶用于糖基工程酵母的表達(dá)和酶活研究。全基因合成丁酰膽堿酯酶基因，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到野生型酵母X 3 3 中誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)，收集的培養(yǎng)上清經(jīng)S D S ．P A G E 電泳分析，電泳圖中觀察不到目的蛋白條帶。通過(guò)膽堿酯酶比色法測(cè)酶活，發(fā)現(xiàn)表達(dá)B C h e 的培養(yǎng)上清可降解特異性底物碘化硫代丁酰膽

7、堿( B S C h ) ，與顯色劑D T N B 發(fā)生顏色反應(yīng)，檢測(cè)到吸光值變化。與稀釋4 0 倍的小鼠血清比較，只有后者酶活的8 0 ％左右，說(shuō)明表達(dá)量較低。利用野生型酵母X 3 3 嘗試表達(dá)丁酰膽堿酯酶單體的研究。天然的丁酰膽堿酯酶為同源四聚體，相對(duì)分子量為3 4 0k D a ，相對(duì)分子量較大，不利于酵母分泌表達(dá)，因此將構(gòu)建丁酰膽堿酯酶單體表達(dá)載體。根據(jù)四聚體是通過(guò)丁酰膽堿酯酶碳端4 0 個(gè)氨基酸相連，利用P C R 技術(shù)構(gòu)建C