諾卡菌16S rRNA基因菌種鑒定及基因組測(cè)序分析.pdf

1、目的：
　　諾卡菌是一種重要的機(jī)會(huì)性致病菌，人類通過(guò)呼吸道或經(jīng)傷口感染后，能引發(fā)多種臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可造成死亡。隨著諾卡菌感染率的逐年增加，逐漸引起人們對(duì)該病原菌的重視。本研究利用16S rRNA基因分析諾卡菌種間的序列，以研究16SrRNA基因分型方法在臨床應(yīng)用中諾卡菌菌種鑒定的應(yīng)用價(jià)值，為臨床應(yīng)用中快速、準(zhǔn)確鑒定諾卡菌奠定基礎(chǔ)。選取20株諾卡菌進(jìn)行二代高通量測(cè)序，應(yīng)用最小核心基因組分型方法對(duì)諾卡菌進(jìn)行分型和鑒定，同時(shí)對(duì)基因組的

2、毒力基因進(jìn)行分析，為諾卡菌的分子分型提供新的思路，也為進(jìn)一步研究諾卡菌的致病機(jī)制提供參考依據(jù)。
　　方法：
　　1.對(duì)49株諾卡菌16SrRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，將獲得的序列與從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的32株諾卡菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行分析，應(yīng)用DNASTAR程序?qū)@81株諾卡菌16S rRNA基因的序列分析處理，計(jì)算種內(nèi)及種間相似性，用MEGA6.06構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
　　2.選取20株諾卡菌，提取核酸構(gòu)建二代

3、高通量測(cè)序文庫(kù)，利用Illumina Hiseq2500高通量測(cè)序平臺(tái)完成文庫(kù)樣品測(cè)序，采用SOAP denovo軟件對(duì)測(cè)序之后得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，應(yīng)用OrthoMCL程序，對(duì)從本研究測(cè)序的20株諾卡菌基因組數(shù)據(jù)和從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的37株諾卡菌基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行最小核心基因組的分析。應(yīng)用Muscle和MEGA6.06軟件，構(gòu)建基于最小核心基因組(minimalcore genome，MCG)的聚類樹(shù)。對(duì)毒力基因的分析，則通過(guò)Pu

4、bmed文獻(xiàn)檢索功能查詢諾卡菌的毒力相關(guān)基因，分析毒力相關(guān)基因在不同諾卡菌的分布情況及毒力基因的同源性研究，并利用Cluster/TreeView軟件畫(huà)出毒力相關(guān)基因分布熱力圖。
　　結(jié)果:
　　1.諾卡菌16S rRNA基因序列種內(nèi)相似性為99.1％～100％，種內(nèi)相似度最高的有鼻疽諾卡菌、短鏈諾卡菌和克魯吉亞諾卡菌，均可達(dá)100％;種內(nèi)相似性最低有星形諾卡菌和南非諾卡菌，分別為99.2％和99.1％。諾卡菌屬16S rR

5、NA基因種內(nèi)及亞種間相似性均在99.0％以上;諾卡菌種間16SrRNA基因序列相似性為95.5％～98.8％，其中膿腫諾卡菌和星形諾卡菌相似度最大，達(dá)98.1％～98.8％;南非諾卡菌和肉色諾卡菌相似性最低，為95.5％～96.0％。
　　2.以膿腫諾卡菌(DSM44432)作為變異點(diǎn)參考序列，分析諾卡菌16SrRNA基因序列中堿基變異位點(diǎn)及其易變區(qū)，諾卡菌16SrRNA基因序列（選取1392bp的測(cè)序可信長(zhǎng)度）存在的堿基變異位點(diǎn)

6、有116個(gè)，易變區(qū)大致可分為4個(gè)，分別在119bp～137bp、515 bp～542bp、919bp～941bp、1031bp～1068bp位點(diǎn)之間。
　　3.基于納入分析的諾卡菌16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，在進(jìn)化樹(shù)中13種諾卡菌大致被聚集為11個(gè)群，還有3種諾卡菌無(wú)法有效分離，屬于新星諾卡菌復(fù)合物即老兵諾卡菌、非洲諾卡菌和克魯吉亞諾卡菌。另外，本研究中所選取的臨床分離株（已被鑒定為鼻疽諾卡菌），在進(jìn)化樹(shù)中與鼻疽諾

7、卡菌標(biāo)準(zhǔn)株聚集成一簇，其親緣關(guān)系也十分相近。
　　4.選取20株諾卡菌進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，共獲得雙末端測(cè)序數(shù)據(jù)40Gb左右，12，608，226個(gè)讀段(read)，每株菌平均測(cè)序深度為418×（基因組上每一個(gè)單堿基平均被測(cè)序或者讀取了418次），最大測(cè)序深度可達(dá)到629×。每株菌的reads經(jīng)過(guò)拼接組裝，基因組大小差異較大，最小為6.08Mbp，最大可達(dá)9.45Mbp;平均可預(yù)測(cè)得到6963個(gè)基因/菌株;平均(G+C)含量為68

8、％。
　　5.對(duì)57株諾卡菌的基因組數(shù)據(jù)使用MCG分型方法分析，獲取225個(gè)基因構(gòu)成最小核心基因組，在整個(gè)基因組中占比不到4％;最小核心基因組基因功能主要以基礎(chǔ)代謝調(diào)控、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。其中，以翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)及生物合成功能占比例最大，其次為翻譯，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，輔酶的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝功能，所占比例最小的是防御功能相關(guān)基因。
　　6.基于核心基因組的串聯(lián)序列，構(gòu)建諾卡菌核心基因組聚類樹(shù)，各個(gè)種的諾卡菌多數(shù)能分在不同的分支上，同種的

9、諾卡菌絕大部分可聚成一簇;而ICDC83老兵諾卡菌與新星諾卡菌、少食和短鏈諾卡菌分別聚在同一分支，且親緣關(guān)系很近;聚集成一簇的鼻疽諾卡菌間遺傳距離不一。
　　7.210個(gè)毒力基因在30種諾卡菌中的攜帶數(shù)量為15(7.1％)～170(80.9％)，其中蓋爾森基興諾卡菌GUH-2內(nèi)毒力基因數(shù)量最多，為170(80.9％);其次為巴西諾卡菌(153，72.8％)、鼻疽諾卡菌(144，68.6％)、Nocardia tenerifensi

10、s(131，62.4％)，均分離自人;諾卡菌屬348MFTsu5所含毒力基因數(shù)量，最少為15(7.1％)，分離自自然界。
　　8.諾卡菌的毒力基因主要編碼過(guò)氧化氫酶，超氧化物歧化酶，細(xì)胞壁脂質(zhì)，蛋白酶，mce蛋白等。210個(gè)毒力基因中，mce基因所攜帶的數(shù)目最多，為48個(gè)，占22.9％;其次為蛋白酶(potease)基因，攜帶有46個(gè)，占21.9％，編碼脂蛋白(Lipoprotein)，亞硝酸還原酶(Nitrite reducta

11、se)基因也有一定數(shù)目，分別為19個(gè)(7.6％)和11個(gè)(5.2％)。
　　9.13個(gè)毒力相關(guān)基因(nfa13050，nfa37890，NOCYR_0626，NOCYR_0144，NOCYR_5051, NOCYR_0327, NOCYR_0407, NOCYR_1396, NOCYR_1397,NOCYR_2248，NOCYR_5510，NOCYR_0085，NOCYR_0548)在57株諾卡菌基因組中均存在，編碼蛋白酶，超氧化

12、物歧化酶，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，烷基氫過(guò)氧化物還原酶，龍膽酸，異檸檬酸裂解酶等，與基礎(chǔ)代謝調(diào)控與物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.16S rRNA基因序列分析是一種簡(jiǎn)單，快速，特異性好的諾卡菌菌種鑒定方法，除了諾卡菌復(fù)合體內(nèi)亞種無(wú)法分離外，能將基他諾卡菌株鑒定至種的水平。可在臨床上廣泛應(yīng)用。
　　2.基于最小核心基因組構(gòu)建聚類樹(shù)中大致能將諾卡菌不同種聚集成不同的群，諾卡菌復(fù)合體亞種也無(wú)法分離開(kāi);但是在鼻疽諾卡菌在MCG聚類