豬細(xì)小病毒河南流行株的分離、鑒定及部分生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)是引起妊娠母豬繁殖障礙的主要病原體之一。該病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)種豬場(chǎng)流行,嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。本研究從河南數(shù)個(gè)發(fā)生母豬繁殖障礙豬場(chǎng)采集的流產(chǎn)、死胎病料中分離到4株病毒,這些毒株均能在PK-15細(xì)胞中增殖,引起細(xì)胞病變(CPE),能凝集0.6％的豚鼠紅細(xì)胞(RBC)并能被豬細(xì)小病毒陽(yáng)性血清所中和,間接免疫熒光檢測(cè)感染細(xì)胞進(jìn)行可見特異的綠色熒光信號(hào)對(duì)。利用PCR方法擴(kuò)增

2、部分ns1基因并與GenBank其他豬細(xì)小病毒序列比較,同源性高達(dá)98％以上。最終將這些分離物鑒定為豬細(xì)小病毒,并分別命名為HNZK-1株、HNZK-2株、HNAY株、HNLH株。通過(guò)設(shè)計(jì)涵蓋豬細(xì)小病毒全基因組的3對(duì)特異性引物,分段克隆豬細(xì)小病毒的基因組片段,對(duì)豬細(xì)小病毒HNZK-1株和HNAY株進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定。結(jié)果表明HNZK-1株和HNAY株基因組全長(zhǎng)分別為4668nt和4610nt,其編碼區(qū)均不存在堿基的插入與缺失,但在v

3、p2終止密碼子處的非編碼區(qū)存在不同程度的堿基缺失,與NADL-2株相比分別缺少15nt和69nt。nsl基因及編碼蛋白的多序列比對(duì)表明HNZK-1株和HNAY株與Nanjing200802株同源性最高。vp2基因及編碼蛋白的多序列比對(duì)表明HNZK-1株和HNAY株與Nanjing200801株同源性最高。遺傳進(jìn)化分析表明,我國(guó)的豬細(xì)小病毒流行毒株在進(jìn)化樹上比較接近。通過(guò)對(duì)HNZK-1株生物學(xué)特性的初步研究,發(fā)現(xiàn)其對(duì)乙醚、氯仿、胰酶、pH

4、3.0的酸、56℃熱處理等均不敏感,在同步接毒培養(yǎng)時(shí)能得到較高的病毒血凝(HA)效價(jià)。病毒經(jīng)甲醛滅活后制成油乳疫苗免疫豚鼠,結(jié)果顯示其能夠誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生高達(dá)210以上的血凝抑制(H1)抗體,免疫后12周抗體滴度幾乎沒(méi)有下降仍能維持較高的抗體水平。與HNZK-1株豬細(xì)小病毒滅活油乳疫苗相比,市售疫苗所夠誘導(dǎo)的HI抗體滴度要低21～22。
　　 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的豬細(xì)小病毒的vp2基因序列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,建立了檢測(cè)PPV的SYBR

5、GreenⅠ實(shí)時(shí)PCR方法。該方法最小檢山量為12個(gè)拷貝每反應(yīng)。模板濃度在108拷貝范圍內(nèi)10倍比稀釋呈良好的線性關(guān)系,與豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病毒無(wú)交叉反應(yīng)。應(yīng)用本方法對(duì)HNZK-1株豬細(xì)小病毒在體外感染細(xì)胞后的復(fù)制動(dòng)態(tài)進(jìn)行了研究,并首次繪制了病毒的體外增殖曲線。數(shù)據(jù)換算成每瓶(25cm2)中細(xì)胞內(nèi)、外病毒拷貝數(shù),結(jié)果顯示細(xì)胞外病毒量在接毒初始的36h逐漸下降,隨后開始逐步增加；接毒后8

6、4h培養(yǎng)液中病毒含量(1.739×1010拷貝)逐漸超過(guò)細(xì)胞內(nèi)的病毒含量(1.321×1010拷貝)。在接毒后108小時(shí)培養(yǎng)液中病毒含量達(dá)到最高點(diǎn)(7.626×1010拷貝),隨即病毒含量開始快速下降。細(xì)胞內(nèi)病毒粒子在接毒后24h內(nèi)為一對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,然后為一緩慢增長(zhǎng)期。至接種后72h達(dá)到復(fù)制最高點(diǎn)(1.425×1010拷貝),接毒后84h略有降低(1.321×1010拷貝),并維持至接毒后108h。與病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)變化相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞病變是從細(xì)

7、胞聚集、開始形成蝕斑到約80％的細(xì)胞病變產(chǎn)生。108h之后隨著細(xì)胞的大量死亡,細(xì)胞內(nèi)、外病毒數(shù)量都開始急劇減少。
　　 參考GenBank所公布的豬細(xì)小病毒核苷酸序列,設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,擴(kuò)增了HNAY株豬細(xì)小病毒的vp2主要抗原基因,將其克隆至pMD18-T載體,測(cè)序獲得873bp核苷酸序列。將其經(jīng)酶切后克隆于pET-32a(+)表達(dá)載體,構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-vp2,將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21(D3)宿主菌中,經(jīng)IP