國(guó)產(chǎn)多孔鉭對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為及功能變化的體外研究.pdf

1、目的：通過(guò)對(duì)醫(yī)用多孔鉭支架材料的物理特性、軟骨細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、軟骨功能活性以及細(xì)胞因子分泌功能的影響進(jìn)行研究，探討多孔鉭材料作為軟骨組織工程支架材料修復(fù)軟骨缺損，恢復(fù)軟骨組織的生理結(jié)構(gòu)與功能的可行性，為進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1掃描電鏡觀察多孔鉭材料的形態(tài)特征。取三周 SD大鼠四肢關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)及鑒定；根據(jù)國(guó)標(biāo) ISO10993-5/ISO10993-12，以F12培養(yǎng)基為浸提

2、介質(zhì)分別制備多孔鉭材料浸提液和多孔鈦材料浸提液，以不同濃度（100％、50%、25%）多孔鉭浸提液培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，多孔鈦浸提液培養(yǎng)和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞分別作為對(duì)照組，通過(guò)倒置相差顯微鏡及 MTT法觀察材料浸提液對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響，檢測(cè)多孔鉭材料的細(xì)胞毒性。2多孔鉭材料與軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，經(jīng)倒置相差顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡等觀察軟骨細(xì)胞在材料上的形態(tài)、黏附、生長(zhǎng)及增殖。3流式細(xì)胞儀檢測(cè)多孔鉭培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞

3、的細(xì)胞周期及凋亡。4二甲基亞甲基藍(lán)比色法定量檢測(cè)多孔鉭材料對(duì)軟骨細(xì)胞合成糖胺多糖的影響。5實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)多孔鉭材料對(duì)軟骨性細(xì)胞因子MMP-13、Aggrecan和II型膠原 mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：1多孔鉭形態(tài)特征：多孔鉭外觀灰色、光亮，材料表面及斷面均可見蜂窩狀孔隙，孔隙分布均勻且呈針尖大小。掃描電鏡觀察下多孔鉭材料的微孔直徑約400～600μm（×500），內(nèi)部孔隙約50～200μm（×1000）且相互連通，

4、多孔鉭材料孔隙連通性好且分布較均勻，結(jié)構(gòu)類似于松質(zhì)骨構(gòu)架。2體外細(xì)胞毒性檢測(cè)：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各濃度多孔鉭浸提液組、多孔鈦浸提液組及完全培養(yǎng)基組的細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，軟骨細(xì)胞形態(tài)均正常，貼壁增殖良好，相同時(shí)間點(diǎn)各濃度多孔鉭浸提液組和兩組對(duì)照組的細(xì)胞增殖活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3多孔鉭材料與軟骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)：倒置相差顯微鏡下可見多孔鉭材料的邊緣及培養(yǎng)板底部黏附大量軟骨細(xì)胞；掃描電鏡可見軟骨細(xì)胞在多孔鉭表面及孔隙內(nèi)能夠良

5、好的黏附、伸展及增殖，細(xì)胞形態(tài)多樣，細(xì)胞間可相互連接，且能夠正常分泌細(xì)胞外基質(zhì)；透射電鏡顯示軟骨細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)大小及形態(tài)均正常，無(wú)明顯改變。4軟骨細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè)：多孔鉭培養(yǎng)組及兩組對(duì)照組細(xì)胞均為正常二倍體細(xì)胞，三組細(xì)胞周期分布相似；多孔鉭組及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率及壞死細(xì)胞率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。5軟骨細(xì)胞糖胺多糖定量檢測(cè)：細(xì)胞在多孔鉭材料上能夠保持軟骨細(xì)胞特異表型，且分泌 GAG。6軟骨細(xì)胞分泌功能檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定

6、量PCR檢測(cè)多孔鉭材料對(duì) MMP-13和II型膠原 mRNA的表達(dá)與完全培養(yǎng)基對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Aggrecan mRNA的表達(dá)上調(diào)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：1軟骨細(xì)胞在多孔鉭浸提液中培養(yǎng)生長(zhǎng)、增殖狀態(tài)良好，說(shuō)明多孔鉭材料對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)毒性。2多孔鉭材料與軟骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，細(xì)胞在其表面與孔隙內(nèi)黏附、生長(zhǎng)及增殖良好，能夠保持細(xì)胞特異表型且正常分泌糖胺多糖，說(shuō)明多孔鉭具有良好的生物相容性。3