細胞色素P450酶系統(tǒng)電子傳遞及底物作用機制的結構生物學研究.pdf

1、細胞色素P450是一類在自然界廣泛分布的血紅素分子依賴的酶蛋白家族，其主要功能是參與機體內(nèi)源分子的生物合成及異源分子的代謝。該家族成員在催化反應過程中所具有的高度特異性使其在環(huán)保、化工和藥物代謝等領域都具有極大的應用價值，因而成為了生物催化研究的熱點。
　　 雖然細胞色素P450的相關研究已歷經(jīng)半個世紀，但對其中三個方面的認識還極為有限：電子傳遞蛋白之間的特異性識別機制；底物如何進入活性中心；突變體影響酶活性的基礎。本論文主要通

2、過結構生物學手段對這三個方面進行了系統(tǒng)的研究和分析。
　　 論文第一部分工作解析了一條來源于Novosphingobium aromaticivoransDSM12444中的Ⅰ類型細胞色素P450電子傳遞系統(tǒng)的三個成員（鐵氧還蛋白還原酶ArR、鐵氧還蛋白Arx和細胞色素P450氧化酶CYP101DI）的三維晶體結構。雖然這些蛋白在整體結構上與已報道的同家族蛋白較為相似，但也具有自身獨特的結構特征，尤其在鐵氧還蛋白還原酶、鐵氧還蛋

3、白和P450蛋白相互識別的表面具有極明顯的差別。通過與另兩條完整的Ⅰ類型電子傳遞系統(tǒng)(PdR/Pdx/CYP101A1和AdR/Adx/CYP24A1)比對，發(fā)現(xiàn)Arx蛋白主要是通過正負電荷相互作用識別ArR和CYP101D1，同時揭示了異源電子傳遞蛋白低效支持P450酶活性的基礎。
　　 論文第二部分解析了細胞色素P450蛋白CYP101D2一種特殊的開放構象，并通過底物樟腦分子浸泡得到的復合物晶體結構揭示了三處潛在的樟腦分子

4、作用位點：活性中心處的樟腦分子以其羰基氧原子與提供血紅素鐵第六配位鍵的水分子作用形成一種罕見的中間態(tài)結合方式；第二處和第三處樟腦分子的結合能力較弱，分別定位于開放通道內(nèi)和酶蛋白分子表面的一個凹槽內(nèi)，我們認為這兩個結合位點很可能是底物識別及轉(zhuǎn)入到活性中心前的中間狀態(tài)。由此我們推測了一條合理的底物進入活性中心的通道，并進一步支持了底物的多步結合機制。
　　 論文的最后一部分工作解析了細胞色素P450蛋白CYP102A1(P450BM

5、3)單加氧酶結構域兩個單點突變體A330P和1401P的晶體結構，闡明了二者在底物催化活性上區(qū)別于野生型蛋白的結構基礎。在突變體A330P的結構中，由于突變造成329位脯氨酸被強行擠入原底物結合通道從而有效限制了活性中心的大小，使得該突變體增強了對非天然小分子底物的催化能力。I401P突變體則在結構上表現(xiàn)出了許多該野生型蛋白在底物結合狀態(tài)下所具有的特征：提供血紅素鐵原子第六配位鍵水分子的異常；近血紅素一側(cè)的loop遠離活性口袋；I螺旋處