基于空化效應(yīng)的通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備關(guān)鍵技術(shù)研究.pdf

1、目的：由病原微生物引起的食品安全事件、突發(fā)傳染病疫情和生物恐怖襲擊總是層出不窮、接連不斷、此起彼伏，不僅危害個人健康和生命安全，而且還容易造成社會恐慌和騷亂。一旦遇到此類可疑情況，如果僅僅依托傳統(tǒng)生物實驗室對可疑微生物樣本進行檢測，從現(xiàn)場采集到樣本轉(zhuǎn)運、分離培養(yǎng)、核酸提取和檢測鑒定，整個流程下來通常需要2~4天才能確定可疑樣本，這顯然滿足不了現(xiàn)場快速應(yīng)急處置的需求。為了提高事發(fā)現(xiàn)場應(yīng)急處置的速度和效率，需要對微生物進行現(xiàn)場檢測和鑒定，通

2、常是采用RT-PCR進行核酸檢測——因為基于RT-PCR的核酸檢測技術(shù)特異性好、靈敏度高，已經(jīng)成為微生物檢測鑒定的“金標準”。
　　目前已經(jīng)存在便攜式RT-PCR儀可以攜至事發(fā)現(xiàn)場使用，然而對于微生物樣本核酸的制備，仍是由操作人員手工完成，不僅費時費力、效率低下、一致性差，而且存在極高的交叉污染風險。現(xiàn)有的核酸自動制備儀，僅實現(xiàn)了核酸制備過程的“自動化”和“標準化”，雖然提高了效率和準確性，但是沒有解決“通用性”和“封閉性”的問題

3、，無法應(yīng)用到現(xiàn)場核酸制備中。
　　基于以上背景，本課題開展通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備的關(guān)鍵技術(shù)研究，為開發(fā)同時滿足“自動化”、“標準化”、“通用化”和“封閉化”的核酸制備系統(tǒng)提供理論支撐和解決方案。
　　方法與內(nèi)容：本課題開展通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備的關(guān)鍵技術(shù)研究，主要從超聲空化裂解細胞的機理研究、非接觸式超聲波微生物樣本細胞裂解的方案設(shè)計和建模分析、多模聯(lián)振增強理論的論證和傳振膜參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計、封

4、閉式核酸分離純化標準化方案的建立和優(yōu)化、通用型封閉式核酸自動制備平臺的設(shè)計與研制等5個部分展開，分別采用的技術(shù)路線和方法是“現(xiàn)象觀察—文獻調(diào)研—流場建?！呀饨！獏?shù)計算”、“現(xiàn)狀分析—方案設(shè)計—建模分析—解析計算—數(shù)值計算”、“理論提出—理論論證—參數(shù)優(yōu)化—平臺搭建—實驗評價”、“現(xiàn)狀分析—方案設(shè)計—體系優(yōu)化—平臺搭建—實驗評價”、“方案設(shè)計—結(jié)構(gòu)設(shè)計—平臺設(shè)計—樣機試制—實驗評價”。具體內(nèi)容如下：
　　（1）超聲空化裂解細胞

5、的機理研究
　　通過現(xiàn)象觀察和文獻調(diào)研，分析超聲空化效應(yīng)能夠裂解細胞的因素來源；然后建立超聲空化中的流場模型，并對其運動規(guī)律進行描述；參照流場中液滴發(fā)生破裂的機理，建立超聲空化流場中細胞發(fā)生裂解的動力學(xué)方程，并對相關(guān)參數(shù)進行計算。
　?。?）非接觸式超聲波微生物樣本細胞裂解的方案設(shè)計和建模分析
　　鑒于現(xiàn)有接觸式超聲波裂解儀存在的諸多缺陷和不足，設(shè)計一種非接觸式超聲波微生物樣本細胞裂解的方案；為研究核心問題，建立非接觸

6、式超聲波裂解方案的簡化模型；根據(jù)彈性體振動的基本理論和方程，計算傳振膜模態(tài)參數(shù)的解析解；然后，基于有限元分析，計算傳振膜模態(tài)參數(shù)的數(shù)值解。
　?。?）多模聯(lián)振增強理論的論證和傳振膜參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計
　　根據(jù)示例傳振膜前十階模態(tài)固有頻率分布的規(guī)律，提出并論證多模聯(lián)振增強理論；為保證最佳的能量傳遞效率，討論并確定傳振膜工作的臺階次序和模態(tài)階數(shù)；探索曲率半徑、厚度和耦合力對傳振膜第二臺階頻率的影響，并對各參數(shù)進行優(yōu)化設(shè)計；然后搭建裂

7、解實驗平臺，開展微生物樣本細胞裂解實驗，從形態(tài)學(xué)、裂解率和核酸檢測三個方面對所設(shè)計的方案進行驗證和評價。
　?。?）封閉式核酸分離純化標準化方案的建立和優(yōu)化
　　鑒于現(xiàn)有的核酸分離純化方法不能移植到現(xiàn)場核酸自動制備中，設(shè)計一種增壓過濾式核酸分離純化方案；然后，對分離純化體系進行構(gòu)建和優(yōu)化；根據(jù)設(shè)計的方案和優(yōu)化的體系，開展微生物核酸分離純化實驗，通過 PCR擴增和凝膠電泳對所設(shè)計的方案和優(yōu)化的體系進行驗證和評價。
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8、5）通用型封閉式核酸自動制備平臺的設(shè)計與研制
　　基于非接觸式超聲波裂解方案和封閉式核酸分離純化方案，設(shè)計通用型封閉式微生物樣本核酸制備的原理方案，并對處理盒的物理結(jié)構(gòu)進行設(shè)計；為了實現(xiàn)處理盒自動化的功能，設(shè)計通用型封閉式核酸自動制備平臺，具體包括機械模塊、電路模塊和控制模塊的設(shè)計與實現(xiàn)；然后，試制四通道樣機，開展微生物核酸自動制備實驗，從細胞濃縮富集效率、核酸產(chǎn)量和質(zhì)量、核酸制備一致性（重復(fù)性）、核酸可檢測性共四個維度對四通道樣

9、機進行性能評測。
　　結(jié)果：按照既定的技術(shù)路線和方法，對通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備課題中的各個部分進行研究，均獲得了預(yù)期成果。
　?。?）超聲空化裂解細胞的機理研究
　　通過現(xiàn)象觀察和文獻調(diào)研，確定了超聲空化能夠裂解細胞的因素來源是機械力的作用；建立了超聲空化中的流場模型——含渦流場模型，描述了超聲空化流場的運動規(guī)律；建立了細胞發(fā)生裂解的動力學(xué)條件，并分別推導(dǎo)了大尺度渦流和小尺度渦流在細胞周圍產(chǎn)生的動壓差的

10、數(shù)學(xué)表達式；根據(jù)細胞發(fā)生裂解的臨界條件，推導(dǎo)了超聲空化場中細胞最大穩(wěn)態(tài)尺寸的理論公式；根據(jù)細胞尺度分布函數(shù)，推導(dǎo)了細胞裂解率的理論表達式。
　?。?）非接觸式超聲波微生物樣本細胞裂解的方案設(shè)計和建模分析
　　設(shè)計的非接觸式超聲波微生物樣本細胞裂解方案，克服了現(xiàn)有接觸式超聲波裂解儀存在的諸多缺陷；建立了非接觸式超聲波裂解的簡化模型，分析了核心和“瓶頸”問題；根據(jù)彈性體振動的基本理論，獲得了傳振膜固有頻率和固有振型的解析解；基于

11、ANSYS模態(tài)分析，獲得了特定參數(shù)（寬度W=12 mm、曲率半徑R=22 mm、厚度T=0.4 mm、受超聲波探頭的耦合力F=3 N）傳振膜前十階模態(tài)固有頻率和固有振型的數(shù)值解。
　?。?）多模聯(lián)振增強理論的論證和傳振膜參數(shù)的優(yōu)化設(shè)計
　　提出并論證了多模聯(lián)振增強理論，為后續(xù)優(yōu)化傳振膜提供了指導(dǎo)思想和基本原則；確定傳振膜應(yīng)該工作在第二臺階頻率上，此時三階模態(tài)（M3）、四階模態(tài)（M4）、五階模態(tài)（M5）和六階模態(tài)（M6）發(fā)生多

12、模聯(lián)振；分別研究了曲率半徑、厚度和耦合力對傳振膜第二臺階頻率的影響，發(fā)現(xiàn)G2臺階頻率隨著曲率半徑的增加而緩慢減小，隨著厚度的增加而快速增加（線性），隨著耦合力的增加而緩慢減小（線性），并對各參數(shù)進行了優(yōu)化設(shè)計；根據(jù)優(yōu)化的參數(shù)，搭建了細胞裂解實驗平臺，開展微生物樣本細胞裂解實驗，從形態(tài)學(xué)、裂解率和核酸檢測三個方面證明了所設(shè)計的非接觸式超聲波裂解方案能有效裂解不同類型的微生物樣本細胞，實現(xiàn)了胞內(nèi)核酸的釋放，具有良好的通用性。
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13、）封閉式核酸分離純化標準化方案的建立和優(yōu)化
　　設(shè)計的增壓過濾式核酸分離純化方案，滿足核酸分離純化過程對封閉化、自動化、標準化、通用性和連貫性的要求；綜合考慮核酸產(chǎn)量和質(zhì)量兩個指標，優(yōu)化了分離純化體系，核酸吸附載應(yīng)當選擇粒徑為1μm的Affimag SLE系列磁性微球，結(jié)合液中NaCl濃度應(yīng)控制在4~5 mol/L，pH值控制在3~4范圍內(nèi)；根據(jù)優(yōu)化的體系，使用增壓過濾式核酸分離純化方案的簡易過濾裝置，對裂解后的大腸桿菌、金黃色葡

14、萄球菌和萎縮芽孢桿菌進行核酸提取，然后通過PCR擴增和凝膠電泳進行效果評測；實驗結(jié)果表明，所建立的增壓過濾式核酸分離純化方案能夠?qū)崿F(xiàn)微生物樣本核酸的分離和純化。
　　（5）通用型封閉式核酸自動制備平臺的設(shè)計與研制
　　設(shè)計了通用型封閉式核酸自動制備平臺，并完成四通道樣機的試制，開展微生物核酸自動制備實驗；實驗結(jié)果表明，在濃縮富集效率方面，微孔濾膜截留率超過90％，處理盒最大濃縮倍數(shù)為59.31倍；在核酸質(zhì)量（純度）方面，四通

15、道樣機制備的核酸純度略低于天根公司 TIANamp Bacteria DNA Kit試劑盒手工制備的核酸，但OD260/280均超過1.6，說明核酸純度較高，可以用于下游檢測分析；在核酸產(chǎn)量（濃度）方面，四通道樣機在革蘭氏陰性細菌核酸制備中的表現(xiàn)不如TIANamp試劑盒，但是在革蘭氏陽性細菌和細菌芽孢核酸制備中的表現(xiàn)均優(yōu)于TIANamp試劑盒，說明四通道樣機具有比較優(yōu)良的細胞裂解能力，但是在核酸分離純化體系上仍需進一步優(yōu)化；在核酸制備一

16、致性方面，四個通道在6次核酸制備中的核酸產(chǎn)量變異系數(shù)分別為5.02%、4.96%、4.74%和5.73%，通道間的核酸產(chǎn)量平均（6次重復(fù)）變異系數(shù)為5.55%，樣機整體變異系數(shù)為5.66%，而TIANamp試劑盒6次試驗的變異系數(shù)高達17.14%，說明四通道樣機在核酸制備中具有良好的一致性（重復(fù)性）；在核酸可檢測性方面，四通道樣機制備的核酸能夠直接用于 RT-PCR檢測，理論上最低檢出限為43 cfu/mL。
　　結(jié)論：本課題了開

17、展了通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備的關(guān)鍵技術(shù)研究，設(shè)計了通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備的系列解決方案，研制了滿足“自動化”、“標準化”、“通用化”和“封閉化”要求的四通道通用型封閉式微生物樣本核酸現(xiàn)場自動制備樣機，并通過實驗從細胞濃縮富集效率、核酸產(chǎn)量和質(zhì)量、核酸制備一致性（重復(fù)性）、核酸可檢測性等多個維度進行了性能評測。實驗結(jié)果表明研制的四通道樣機能夠用于多種類型微生物樣本的核酸自動制備，不僅濃縮富集效率高，而且制備的