兩株海洋微生物的活性次級代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、當今的醫(yī)藥環(huán)境迫切地需要新的藥物，特別是能殺死具有抗性的病原體的抗生素。盡管在生物合成和化學(xué)合成領(lǐng)域，抗生素的合成已經(jīng)取得了巨大的進步，但自然界仍是新抗生素的最大來源。海洋為海洋生物提供了巨大而多樣的棲息地。由于海洋環(huán)境多變的性質(zhì)，如溫度、壓力、鹽度、金屬濃度，海洋環(huán)境和缺氧海洋沉積物是海洋生物產(chǎn)生新型化合物的重要來源。具有生物多樣性的特殊海洋環(huán)境是生物活性天然產(chǎn)物的豐富來源，其中許多天然產(chǎn)物在陸地上未能發(fā)現(xiàn)。海洋生物的獨特性導(dǎo)致海洋天

2、然產(chǎn)物的多樣性。近幾十年來，由于其多種生物活性和廣泛的用途，海洋天然產(chǎn)物受到廣泛關(guān)注?，F(xiàn)如今已有包括萜類化合物、類固醇、酚類化合物、生物堿多糖、肽、聚酮化合物和脂肪酸在內(nèi)的16000種天然產(chǎn)物已經(jīng)從海洋中分離出來。海洋微生物，尤其是海洋真菌和放線菌，已經(jīng)被證明是尋找結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物的巨大寶庫。放線菌在耐火生物材料的回收和具有藥物作用的新次級代謝物的生產(chǎn)中發(fā)揮重要的生態(tài)學(xué)作用。放線菌是抗生素的主要生產(chǎn)者，能產(chǎn)生多種次級代謝物。放線菌

3、產(chǎn)生的抗生素約占三分之二。放線菌因其產(chǎn)生次級代謝物的能力而受到廣泛關(guān)注。生活在嚴苛環(huán)境中的海洋真菌作為新的生物活性產(chǎn)物來源而受到科學(xué)工作者關(guān)注由于海洋熱液口是地球上最有生產(chǎn)力的環(huán)境，因此極端微生物的次生代謝物多樣性相當高。Loihichelins和Ammonificins是海洋熱液口來源的新天然產(chǎn)物的第一份報道。只有少數(shù)來自螃蟹的海洋真菌已經(jīng)被研究。本項研究中，我們選擇一株源自東海沉積物的鏈霉屬放線菌H-1003和一株源自臺灣龜山島富含

4、硫的熱液口真菌XZ-1。本研究的目的是從海洋放線菌和真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中分離具有藥用價值的生物活性化合物。本論文將從兩個方面研究海洋放線菌和真菌的次級代謝產(chǎn)物。首先，篩選生物活性化合物來從海洋微生物中得到抗生素。其次，運用生物和非生物脅迫的新策略來發(fā)現(xiàn)新的生物活性化合物。最后，對微生物產(chǎn)生的生物活性化合物進行評價和表征。真菌和放線菌菌株都在正常和金屬脅迫條件下培養(yǎng)。用乙酸乙酯萃取培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物，并通過TLC、柱色譜、制備型HPL

5、C等不同的光譜技術(shù)進行純化。通過HPLC，UV和NMR鑒定純化合物的結(jié)構(gòu)。通過Spot方法研究它們對金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的體外抗菌活性。
　　微生物具有對生物和非生物脅迫產(chǎn)生抗性并保持其適應(yīng)性的各種機制。隨著分子生物學(xué)和化學(xué)生物學(xué)技術(shù)的進步，已經(jīng)證實次級代謝物在微生物對環(huán)境的適應(yīng)過程中起著重要作用。在病原體攻擊，重金屬脅迫，傷害，輻射或高可見光水平等生物和非生物脅迫下，微生物會合成抗脅迫化合物。一些研究表明使用生

6、物和非生物誘導(dǎo)劑可以增加海洋微生物次級代謝物的產(chǎn)量。通過化學(xué)方法誘導(dǎo)，包括重金屬，是藥物發(fā)現(xiàn)的新技術(shù)之一。在本研究中，海洋放線菌菌株H-1003分別在有、無金屬脅迫下培養(yǎng)。用不加任何金屬離子的空白培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株H-1003，但在空白培養(yǎng)基提取物中沒有觀察到峰。選用Gause，M1和ISP2這三種不同類型的培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基。選用0.5mM、1mM、2mM和4mM/L這四種濃度的五種金屬Co2+、Ni2+、Zn2+、Cr2+、Cd2+來

7、篩選適合H-1003菌株的金屬離子。180轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)10天后，除去菌絲體，用等體積的EtOAc萃取培養(yǎng)基兩次。結(jié)果表明，放線菌的代謝模式隨Co2+、Cr2+、混合金屬(Co2++Cd2+)的刺激而改變，產(chǎn)生4種新的代謝物。新產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物經(jīng)制備型高效液相色譜分離，質(zhì)譜、核磁結(jié)構(gòu)鑒定，被確認為四個已知化合物enterocin(1)，anhydromevalonolactone(2),cyclo-trans-4-OH-(D)-Pro-(D

8、)-Phe(3)and L,L-cyclo(phenylalanyl-tryptophyl)(4)。由于化合物1有包含單取代苯環(huán)和甲氧基化的α-吡喃酮環(huán)的獨特骨架以及極強的抗菌活性，使得該化合物與其他代謝產(chǎn)物具有顯著地不同。因此利用響應(yīng)面分析法進一步研究了化合物1enterocin的產(chǎn)量。優(yōu)化后的金屬脅迫條件為2mM/L濃度的Co2+，20mg淀粉的高氏培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為10天，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)每分鐘。在此條件下，enterocin的產(chǎn)

9、量被提升至5.33mg/L，這遠遠高于對照組的產(chǎn)量?；衔?還顯示出抗菌活性，對金黃色葡萄球菌MIC值為62.5μg/ml，對大腸桿菌MIC值為31.25μg/ml，對枯草芽孢桿菌MIC值為31.25μg/ml。1mM濃度的Cr2+脅迫菌株H-1003出現(xiàn)化合物2和3的兩個新峰。在其他濃度下僅產(chǎn)生化合物2，1mM是得到化合物2和3的最佳濃度。Co2+和Cd2+的混合金屬脅迫菌株H-1003產(chǎn)生化合物4的一個新峰。在此之前，使用單一金屬脅

10、迫時，在該區(qū)域沒有觀察到峰，使用兩種金屬一起脅迫使該區(qū)域出現(xiàn)峰。4種不同的金屬離子濃度下均可產(chǎn)生這一新峰。該實驗證明，使用兩種金屬同時脅迫可以得到使用單金屬脅迫時不會產(chǎn)生的新化合物，并且海洋微生物可以非常好地適應(yīng)不同濃度金屬離子的脅迫。
　　由于獨特及嚴酷的生長環(huán)境，使得海底熱液口微生物成為海洋天然產(chǎn)物的研究熱點。如今從海洋熱液口環(huán)境中得到新的化合物的報道較少，其中少有關(guān)于海洋熱液口螃蟹的研究。熱液口螃蟹中的海洋細菌和真菌非常難以

11、在陸地條件的培養(yǎng)基上生長。本研究中，從熱液口螃蟹Xenograpsus testudinatus內(nèi)臟中分離得到的真菌菌株XZ-1可以在正常的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過TLC，柱色譜和制備型HPLC分離和純化真菌的代謝物，并通過HPLC-MS，UV和NMR鑒定化合物。生物活性指導(dǎo)篩選得到5種化合物。首先對篩選初步純化物質(zhì)的生物學(xué)潛力，之后對有生物活性的部分進行進一步純化。初始篩選針對包括金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，枯草芽孢桿菌，銅綠假單胞菌，

12、肺炎克雷伯氏菌和白色念珠菌等許多細菌和真菌病原體。5個化合物均為已知化合物，分別是Ergosterol(5)，Homodimeric WIN64821(6),Hydroxysydonic acid(7),Diorcinol(8)和Cordyol C(9)?；衔?為無色晶體，是已知化合物谷甾醇，對各種癌細胞系均存在細胞毒性。獨特結(jié)構(gòu)的化合物6具有強的神經(jīng)激肽拮抗劑活性和抗腫瘤活性?；衔?對金黃色葡萄球菌有抗菌活性。文獻報道化合物8和化

13、合物9對抗細菌和真菌病原性菌株產(chǎn)生有效的結(jié)果，因此在初始抗微生物篩選中被選擇為有效的抗微生物劑。純化后，兩種化合物都被鑒定為已知化合物。文獻報道化合物9具有強抗病毒活性。所有化合物的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過1H、13C、DEPT和文獻查證確定
　　海洋環(huán)境中蘊含著大量的新穎化合物，是一個未開發(fā)的藥物寶庫，今后仍將有助于尋找新藥。因為獨特的環(huán)境，海洋熱液口已經(jīng)成為了研究人員的新焦點。大規(guī)模培養(yǎng)海洋真菌和放線菌來發(fā)現(xiàn)新的天然抗生素的過程仍需要許多