兩株海綿來源真菌活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究.pdf

1、海綿的體表及體內(nèi)積聚了大量的微生物，這些微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，是新藥先導(dǎo)化合物的重要來源。為了尋找新的活性先導(dǎo)化合物，本論文采用了活性篩選和現(xiàn)代化學(xué)篩選相結(jié)合的方法，選取了2株海綿來源具有抗腫瘤和抗炎活性真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)研究。 從海南瓊海及三亞附近海域的27個(gè)海綿樣品中分離得到了208株微生物。采用SRB法，以小鼠白血病P388腫瘤細(xì)胞為篩選模型進(jìn)行體外抗腫瘤活性的一級(jí)、二級(jí)篩選，并結(jié)合HPLC指

2、紋圖譜及薄層色譜進(jìn)行化學(xué)篩選，得到具有較強(qiáng)細(xì)胞毒活性的菌株15株。對(duì)15株活性菌株同時(shí)進(jìn)行抗炎活性篩選，其中2株具有強(qiáng)抗炎活性的海綿真菌，經(jīng)ITS序列進(jìn)行測(cè)序比對(duì)后，鑒定為附球菌屬Epicoccum sp.JJY－40和鏈格孢屬Alternaria sp.JJY－32，因此本文選擇這2株活性菌株作為研究目標(biāo)。 在考察了2株目標(biāo)菌株的培養(yǎng)條件后，對(duì)目標(biāo)活性菌進(jìn)行了大量發(fā)酵。對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物運(yùn)用萃取，薄層色譜，正相、反相硅膠柱色譜，LH－

3、20凝膠柱色譜，反相高壓液相等化學(xué)的分離純化手段，從附球菌屬Epicoccum Sp.JJY－40的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到18個(gè)單體化合物(1－15，29，30，31)；從鏈格孢屬.Alternaria sp。JJY－32的次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離得到16個(gè)單體化合物(16－28，32，33，34)，共34個(gè)化合物。 繼而，利用理化性質(zhì)和波譜學(xué)方法(IR，Uv，MS，NMR，X－ray)結(jié)合化學(xué)反應(yīng)的方法(乙?；磻?yīng)等)闡述了其中28

4、個(gè)化合物(1－28)的化學(xué)結(jié)構(gòu)(化合物結(jié)構(gòu)及名稱參見Table1)，其中新化合物12個(gè)。新化合物結(jié)構(gòu)類型包括：萜類衍生物(18－25，27，28)，Aucubinine B的羥基化衍生物(8)以及吡喃衍生物(15)。其中，新化合物18－25為系列具有新穎側(cè)鏈的萜類衍生物，此類結(jié)構(gòu)以前未曾報(bào)道，新化合物28為一罕見的雜螺環(huán)萜類衍生物。其它已知化合物分別為4個(gè)苯的衍生物(1－4)、4個(gè)二酮哌嗪(6，9－11)、1個(gè)糖苷(12)、1個(gè)核苷(1

5、3)、3個(gè)生物堿(5，7，14)、1個(gè)甾醇類化合物(16)以及2個(gè)Tricycloaltemarene類萜類衍生物(17，26)。 先天性免疫是機(jī)體抗感染的第一防線，而巨噬細(xì)胞在其中發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用，RAW264.7細(xì)胞可以很好的模擬體內(nèi)的巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，LPS可以通過刺激細(xì)胞因子的分泌而激活巨噬細(xì)胞，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，因此實(shí)驗(yàn)利用LPS刺激下的RAW264.7細(xì)胞作為細(xì)胞模型，采用ELISA，RT－PCR，Western Bl

6、ot和免疫熒光染色的篩選方法，對(duì)部分單體化合物的體外免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)化合物15和17可以明顯的抑制LPS誘導(dǎo)的TNF－α和NO的分泌以及mRNA基因的表達(dá)，同時(shí)這些化合物亦可以明顯的抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS以及COX－2的表達(dá)，說明化合物15和17具有很強(qiáng)的免疫炎癥抑制作用。此為化合物15和17抗炎活性的首次報(bào)道。剩余新化合物的構(gòu)型和抗炎、抗腫瘤活性正在評(píng)價(jià)過程中。 綜上，本文從海綿樣品中共分離篩選出15株細(xì)胞毒