全基因組擴增方法的建立及其在法醫(yī)學中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景與目的 在法醫(yī)學檢案實踐中，常遇到樣本DNA含量極其有限，以致DNA分型無法完成或不能滿足重復(fù)檢測的需要。因此，對微量模板DNA分析便成為法醫(yī)學DNA檢驗的一個難題。以PCR-STR為代表的遺傳標記分析技術(shù)雖然一定程度上解決了法醫(yī)學微量檢材的難題，但一些檢材仍因DNA含量極其有限而無法檢測成功,或僅檢出少數(shù)基因座而無法使累計鑒別能力達到認定水平。這類檢材被稱為痕量DNA，也稱低拷貝模板(low copy number，L

2、CN)，Gill等將其定義為低于100pg的模板DNA。為解決這一難題，有研究用增加PCR循環(huán)數(shù)，但模板DNA量太低時易產(chǎn)生等位基因丟失或非特異帶，且循環(huán)數(shù)增加到一定程度后再增加循環(huán)數(shù)也不會顯著增加靈敏度；另外，有人試圖用巢式PCR，但巢式PCR技術(shù)僅限于單一位點分析，無法提高目前法醫(yī)學中常規(guī)DNA檢測所用的多位點復(fù)合擴增所需的模板數(shù)量。全基因組擴增(Whole Genome Amplification，WGA)是一種能從有限的DNA樣

3、品獲得充足的DNA量供后續(xù)分析的技術(shù)，其基本思路是通過對微量組織甚至單個細胞的整個基因組DNA擴增，大幅度增加DNA的總量。因此被認為是目前可以解決上述難題的一種有效方法。 WGA技術(shù)經(jīng)10余年探索，在方法上已逐步發(fā)展和不斷完善起來，已被廣泛用于疾病基因研究等領(lǐng)域，并取得了良好的效果。但在法醫(yī)學方面的應(yīng)用很少。在目前常用的幾種WGA方法中，改良擴增前引物延伸方法(Improved primer extension preampl

4、ification，IPEP)和多重置換擴增方法(Multiple displacement amplification，MDA)對STR基因座分型顯示出較好的效果。故本研究探討了這兩種方法用于法醫(yī)學微量檢材的效果，包括對其靈敏度、擴增忠實性、能否用于法醫(yī)學常用STR基因座及常用檢材等進行系統(tǒng)性研究，從而對其用于法醫(yī)學實踐的可行性進行評價，并建立穩(wěn)定可行的技術(shù)方案。 方法 1.對30例口腔拭子樣品，采用酚-氯仿法提取DN

5、A，實時熒光定量PCR技術(shù)定量，并分別稀釋成1ng、0.5ng、0.1ng、0.05ng、0.025ng、0.01ng六種模板量DNA，然后進行MDA反應(yīng)和IPEP反應(yīng)。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測MDA方法和IPEP方法的產(chǎn)物濃度，比較兩種方法的擴增效率。分別以MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物為模板DNA，用AmpFLSTR@Identifiler@試劑盒擴增，ABl3100基因分型儀檢測基因型，比較MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物用于STR分型的

6、效果。 2.對IPEP方法反應(yīng)體系的成分和終濃度進一步優(yōu)化，建立改良IPEP方法，并檢測其擴增效率和STR分型效果。將改良IPEP方法用于30例血液、30例血紗、30例精液等三類法醫(yī)學常見生物檢材進行檢測，觀察改良IPEP方法的可重復(fù)性和對法醫(yī)學常見生物檢材的適用性。 3.將改良IPEP方法用于20例汗?jié)撝赣　?0例一次性牙刷、20例自然脫落頭發(fā)等三種法醫(yī)學常見疑難微量檢材的模擬案例，觀察改良IPEP方法對上述檢材的ST

7、R分型效果；用于現(xiàn)場果核10例、礦泉水瓶10例、煙蒂10例、衣領(lǐng)10例等實際案例，觀察改良IPEP方法的實際案件檢驗?zāi)芰Α?結(jié)果 1.MDA法產(chǎn)量為5.15ug～19.75ug，可對模板DNA增加5.15x103～1.98x106倍：IPEP法產(chǎn)量為0.5ng～66ng，可對模板DNA增加25～310倍。MDA法產(chǎn)物濃度高于IPEP法，差異有顯著性意義(F=3643.433,P<0.001)。 2.常規(guī)檢測法、M

8、DA法、IPEP法的基因座檢出數(shù)有顯著性差異(F=1033.297,P<0.001.)。當DNA模板量為1ng時，常規(guī)檢測方法、MDA方法、IPEP方法均可獲得復(fù)合擴增系統(tǒng)所有基因座的準確分型結(jié)果：當DNA模板量為0.5ng時，常規(guī)檢測方法和IPEP方法均獲得所有基因座的準確分型結(jié)果，MDA方法獲得10個以上基因座的準確分型結(jié)果：當DNA模板量為0.1ng～0.01ng時，MDA方法基因座檢出數(shù)高于常規(guī)檢測方法，IPEP方法基因座檢出數(shù)

9、高于MDA方法。 3.DNA模板量≥1ng，其MDA產(chǎn)物雜合子基因座的等位基因擴增均衡；DNA模板量≤0.5ng，其MDA產(chǎn)物的STR分型圖譜可見等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象，且模板DNA量越低，等位基因不平衡或丟失現(xiàn)象越明顯。DNA模板量≥0.05ng，其IPEP產(chǎn)物雜合子基因座的等位基因擴增均衡；DNA模板量≤0.025ng，其IPEP產(chǎn)物的STR分型圖譜可見等位基因不平衡或丟失。MDA產(chǎn)物和IPEP產(chǎn)物用于STR分型時均未觀察