人類MEKK3蛋白質(zhì)PB1結(jié)構(gòu)域及Mog1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、本論文的工作重點包括：人類MAPKs家族激酶MEKK3的N端PB1結(jié)構(gòu)域的克隆，表達(dá)，純化并用核磁共振的方法解析了溶液中MEKK3 PB1結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)。在結(jié)構(gòu)解析的過程中，我們發(fā)現(xiàn)了MEKK3 PB1中存在著有趣的脯氨酸順反異構(gòu)現(xiàn)象?；诮Y(jié)構(gòu)，我們研究了MEKK3 PB1與其下游激酶MEK5的N端PB1結(jié)構(gòu)域的相互作用。我們的另一項工作是解析了人類Mog1蛋白的溶液結(jié)構(gòu)，并初步研究了其與核轉(zhuǎn)運蛋白Ran的相互作用。 第一章是對

2、MAPK信號通路家族及PB1結(jié)構(gòu)域的一個綜述。MAPK信號通路參與了許多生理和病理過程，其中ERK5信號通路是唯一由PB1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的MAPK信號通路，PB1結(jié)構(gòu)域是新近發(fā)現(xiàn)的蛋白一蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，它參與了很多信號通路的傳遞。 第二章中，我們解析了人類MEKK3 PB1結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)。MEKK3 PB1在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)Ni離子親和層析柱純化，用于核磁共振實驗。MEKK3 PB1結(jié)構(gòu)具有典型的ubiquitin-lik

3、e折疊方式，包含5段β-折疊片和2段α-螺旋的緊密球狀蛋白結(jié)構(gòu)域。5段β-折疊片以平行和反平行的方式排列，2段α-螺旋以幾乎互相垂直的方式排列，處于5段β-折疊的另一側(cè)。整個結(jié)構(gòu)中含有一個疏水核心，對穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)揮重要的作用。令我們感興趣的是，我們在HSQC譜圖上意外地發(fā)現(xiàn)了一些強(qiáng)度相對較弱的峰，經(jīng)過分析，我們認(rèn)為MEKK3 PB1中存在著多種構(gòu)象，且所占比例不同。在HSQC譜圖上，越靠近Pro39的殘基，兩種構(gòu)象間的化學(xué)位移差越大。

4、考慮到以上這些，我們猜測很可能是Gln38-Pro39間肽鍵的順反異構(gòu)作用造成了MEKK3 PB1構(gòu)象的多樣性。NOE及化學(xué)位移的信息證實了我們的猜測。這種順反異構(gòu)的現(xiàn)象在PB1結(jié)構(gòu)域中還是第一次發(fā)現(xiàn)。順式與反式異構(gòu)體主鏈之間最大的差別在Pro39所在的連接α1和β3的G37-L40轉(zhuǎn)角區(qū)域。在順式構(gòu)象下，這一區(qū)域形成一個第六類b β-轉(zhuǎn)角(VIb β-turn)。反式構(gòu)象下，該區(qū)域則不屬于任何典型的β-轉(zhuǎn)角。主鏈動力學(xué)研究揭示了MEK

5、K3 PB1的β3/β4轉(zhuǎn)角可能存在著毫秒到微秒時間尺度的運動。然后，我們進(jìn)一步研究了MEKK3 PB1與MEK5 PB1的相互作用。ITC和SPR實驗顯示MEKK3 PB1與MEK5 PB1的解離常數(shù)達(dá)到了10<'-8> M，這是很強(qiáng)的相互作用。通過定點突變實驗，我們發(fā)現(xiàn)了在MEKK3 PB1的作用界面上，不同的殘基對結(jié)合的貢獻(xiàn)是不一樣的。Lys7作為高度保守的殘基，在MEKK3 PB1結(jié)合MEK5 PB1發(fā)揮了非常重要的作用。K7A

6、突變幾乎完全阻斷了MEKK3 PB1與MEK5 PB1的相互結(jié)合。R5A突變也使得它們的相互作用大幅減弱，與此相反的是，R14A和R76A僅僅使相互作用稍有減弱。因此，我們認(rèn)為Lys7和Arg5在MEKK3 PB1與MEK5 PB1的相互作用中發(fā)揮著非常重要的作用。第三章中，我們解析了人類Mog1蛋白的溶液結(jié)構(gòu)。Mog1蛋白是一個186個氨基酸的與核轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白。我們用大腸桿菌表達(dá)了Mog1，經(jīng)Ni離子親和層析柱純化，用于核磁實驗。M

7、og1含有9段β折疊，2段α螺旋和2段3<,10>螺旋。其中7段β折疊以平行和反平行的方式依次排列，兩段α螺旋分別處于這組β折疊的前面和后面，形成夾心結(jié)構(gòu)。人Mog1與酵母Mog1最主要的一個差別是，在人Mog1蛋白中，146-164位的氨基酸形成一個很大的loop區(qū)，而在ScMog1中相對應(yīng)的位置則是一段α螺旋。我們通過凝膠過濾色譜證實了Mog1可以與Ran形成穩(wěn)定的復(fù)合物，然而，我們尚未確定它們相互作用的界面，這方面的信息需要進(jìn)一步