人類ZO2蛋白質(zhì)第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)和功能的研究.pdf

1、本文對人類ZO1和ZO2蛋白的第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了克隆、表達(dá)、純化以及結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究，克隆、表達(dá)、純化了ZO1和ZO2蛋白的第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域(ZO1-PDZ2及ZO2-PDZ2)，并用核磁方法解析了ZO2-PDZ2的溶液結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新奇的PDZ結(jié)構(gòu)域的二聚化模式，即通過三維空間結(jié)構(gòu)域交換形成了二聚體。快速蛋白液相色譜(FPLC)及分析性超速離心(AUC)都證明ZO1-PDZ2及ZO2-PDZ2均以二體的形式存在，且二

2、聚體很穩(wěn)定，因?yàn)橛贸两邓俾史治龅姆椒ㄎ窗l(fā)現(xiàn)它們有單體存在。此外，我們進(jìn)行了體內(nèi)免疫共沉淀及體外的GST pull-down實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均表明ZO1-PDZ2和ZO2-PDZ2能直接相互作用，并且同時(shí)發(fā)現(xiàn)ZO1-PDZ2和ZO2-PDZ2自身也能相互作用。在體外利用了DSS對蛋白進(jìn)行了交聯(lián)實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，結(jié)果表明這兩種蛋白在溶液中都存存不均一的聚集。這種ZO蛋白由PDZ介導(dǎo)的寡聚化可能為claudins跨膜蛋白的聚合提供了結(jié)構(gòu)基

3、礎(chǔ)。 在第一章中，綜述了緊密連接和ZO蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在組織和不同的細(xì)胞間形成了選擇性的屏障，它們發(fā)生了極化，且通過細(xì)胞間的復(fù)合物互相連接，這些復(fù)合物包括緊密連接、粘性連接和橋粒。緊密連接是連接復(fù)合物中最靠近頂點(diǎn)的成分，通過在細(xì)胞間形成連續(xù)的帶狀結(jié)構(gòu)隔離了頂點(diǎn)和側(cè)質(zhì)膜。緊密連接在調(diào)控離子通過旁細(xì)胞途徑時(shí)發(fā)揮重要的作用，也是血腦屏障發(fā)揮功能所必需的，血腦屏障中緊密連接若被破壞會(huì)導(dǎo)致很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。

4、 緊密連接由不同的跨膜蛋白包括occludin，claudin和JAMs組成，這些跨膜蛋白通過腳手架蛋白如ZO蛋白與細(xì)胞骨架相連。ZO蛋白屬于膜相關(guān)的鳥苷酸激酶家族(MAGUKs)，這些蛋白含幾個(gè)蛋白-蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，包括三個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域、一個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域和一個(gè)GK結(jié)構(gòu)域，它們主要定位于連接復(fù)合物的膜下區(qū)，把多個(gè)完整的膜蛋白交聯(lián)到細(xì)胞質(zhì)表面，產(chǎn)生特殊的膜區(qū)域。 最近的研究已經(jīng)揭示了ZO蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域。ZO1通過第二

5、個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域與ZO-2/ZO-3的第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域相互作用。Utepbergenov等的研究顯示在MDCK細(xì)胞中有ZO1同二聚體的存在，而且第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域是二聚必需、充分的條件。而在Umeda的研究中報(bào)道ZO1的SH3/GK模塊是二聚必需的。 ZO蛋白的二聚或寡聚在決定它們配體的性質(zhì)方而起很重要的作用。Claudins跨膜蛋白被看作是緊密連接的骨架，在參與跨細(xì)胞通道和孔的形成中，它們可以同源或異源寡聚。ZO蛋白通過第一個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)

6、合到claudin YV末端，二聚的ZO1(可能ZO2也是)不僅發(fā)動(dòng)了claudin聚合，即緊密連接的形成，也決定了緊密連接的正確定位。 在第二章中，敘述了ZO1-PDZ2及ZO2-P1322得到了克隆、表達(dá)和純化，ZO2-PDZ2的溶液結(jié)構(gòu)用NMR方法得到了解析。出乎意料的是，ZO2-PDZ2通過交換三維空間結(jié)構(gòu)域形成了緊密的二重對稱的同二聚體結(jié)構(gòu)。這種二聚體結(jié)構(gòu)非常適合ZO蛋白在緊密連接中發(fā)揮緊密連接的功能。 ZO2

7、-PDZ2在β2a和β2b區(qū)域獨(dú)特的氨基酸序列很可能導(dǎo)致了這種三維空間結(jié)構(gòu)域交換的同二聚體的形成。前人的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PDZ結(jié)構(gòu)域的幾種二聚的模式，例如ShanklPDZ和GRIPPDZ6，通過多序列比對分析，ZO2-PDZ2缺少它們?chǔ)?-β3片層間的長的Loop，這意謂著在ZO2-PDZ2中β2a和β2b之間的連接太短而不能折回到同一單體形成一對反平行的β片層，從而形成這種三維空間結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)。因?yàn)閆O蛋白的第二個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域有

8、高度的保守性，我們猜想這種三維空間結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)也同樣適用于同二聚體ZO1-PDZ2和ZO3-PDZ2，異二聚體ZO1-PDZ2/ZO2-PDZ2利ZO1-PDZ2/ZO3-PDZ2。ZO2-PDZ2緊密的二聚體結(jié)構(gòu)應(yīng)歸因于每個(gè)亞基N端的兩個(gè)β-片層的交換，從而產(chǎn)生眾多的氫鍵和廣泛的疏水相互作用。 此外，利用體外的GST pull-down和體內(nèi)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)來說明ZO1-PDZ2和ZO2-PDZ2之間的相互作用，我們證明它