神經生長因子對上皮性卵巢癌細胞生物學行為的影響及相關機制研究.pdf

1、卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內膜癌，嚴重危害女性的生命健康。卵巢癌是高度異質性腫瘤，組織學亞型較多，不同類型的卵巢癌在形態(tài)特征、臨床表現(xiàn)、遺傳改變、腫瘤行為等方面均表現(xiàn)出一定的差異，且難以在早期發(fā)現(xiàn)，易發(fā)生轉移、化療耐藥、復發(fā)，使卵巢癌的診斷和治療都面臨著極大的挑戰(zhàn)。卵巢癌的致病機理十分復雜，至今仍未完全闡明。一般的觀點認為卵巢癌的發(fā)生既與卵巢特殊的解剖結構、機械刺激等有關，也與卵巢微環(huán)境中生長因子、黏附

2、因子、免疫炎性反應因子等的功能失調而導致細胞內信號分子發(fā)生異位、突變、丟失、結構重排等使細胞的正常生長、增殖、分化、凋亡失控而引起細胞惡性轉化相連。神經生長因子（NGF）是一種多效性的肽類激素，通過與靶細胞表面的高親和力受體TrkA和低親和力受體P75結合來調控細胞的存活、生長、分化、凋亡等生理活動，對機體正常生理狀態(tài)和病理發(fā)展有重要的影響。近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)：NGF及受體（NGFRs）在乳腺癌、前列腺癌、成神經細胞瘤等惡性腫瘤中廣泛

3、表達，異常表達的NGF/NGFRs影響腫瘤的發(fā)生、生長、增殖、分化、侵襲、轉移、預后等過程。NGF/NGFRs在正常卵巢組織中低表達，能調節(jié)垂體分泌卵泡刺激素（FSH）及卵巢上皮表面FSH受體水平、卵泡發(fā)育、排卵等卵巢正常生理功能，異常表達的NGF/NGFRs會引起卵泡刺激素分泌紊亂，導致上皮性卵巢癌的啟動和發(fā)生。但NGF/NGFRs參與卵巢癌的啟動、發(fā)生、發(fā)展及作用機理等方面的知識了解甚少，作用機制尚未完全闡明。因此，深入了解NGF/

4、NGFRs對卵巢癌細胞生物學行為的影響及相關分子機制，對卵巢癌的預防、診斷、治療、預后等有重要意義。本文的主要研究內容包括：
　　①考察NGF/NGFRs在卵巢癌細胞系中的表達。采用定量RT-PCR和Western blot法檢測常規(guī)培養(yǎng)（含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基）條件下NGF/NGFRs在卵巢癌細胞系A2780、SKOV3、OVCAR3、CAOV3中的表達情況。結果顯示：NGF/NGFRs均同時在這幾種卵巢癌細胞中表達，內源

5、性的NGF在OVCAR3、CAOV3細胞中表達水平較高，為后續(xù)實驗奠定了細胞學基礎。
　?、诳疾霳GF/NGFRs對卵巢癌細胞存活、生長、增殖、細胞周期、生長節(jié)律、凋亡的影響。采用細胞行為學觀察實驗、定量RT-PCR、Western blot等方法檢測NGF/NGFRs對卵巢癌細胞存活、生長、增殖、細胞周期、生長節(jié)律、凋亡相關基因和蛋白表達的影響。通過特異性的NGF/NGFRs抑制劑阻斷NGF/NGFRs的作用，考察NGF/NGF

6、Rs在卵巢癌細胞存活、生長、增殖、細胞周期、生長節(jié)律、凋亡中的作用。結果顯示：NGF下調CAOV3和OVCAR3細胞中SIRT1（Sirtuin1）、Survivin的表達水平，減弱卵巢癌細胞的存活能力；NGF上調CAOV3和OVCAR3細胞中Ki67、PPARδ，下調PCNA的表達水平，抑制卵巢癌細胞的增殖能力；NGF上調CAOV3和OVCAR3細胞中Cyclin E1、P21，下調Cyclin D1的表達水平，影響卵巢癌的周期調控，

7、促進卵巢癌細胞的凋亡；NGF下調CAOV3和OVCAR3細胞中Clock、FBXL3的表達水平，影響卵巢癌細胞的生長節(jié)律，但具體的生物學效應還需要進一步深入研究；NGF上調CAOV3和OVCAR3細胞中P53、BCL2、Caspase9，下調Caspase3、Caspase7的表達水平，上調CAOV3細胞中CYCS的表達而下調OVCAR3細胞中的CYCS，下調CAOV3細胞中BAX的表達而上調OVCAR3細胞中的BAX，影響卵巢癌細胞的

8、凋亡過程。
　?、劭疾霳GF/NGFRs對卵巢癌細胞粘附能力的影響。采用細胞粘附實驗、定量RT-PCR、Western blot等方法檢測NGF/NGFRs對卵巢癌細胞粘附能力、緊密連接相關基因mRNA和蛋白表達的影響。結果顯示：NGF上調CAOV3和OVCAR3細胞中緊密連接蛋白CLDN3、CLDN4的表達水平，下調CAOV3細胞中緊密連接蛋白CLDN1的表達而上調OVCAR3細胞中的表達水平，影響卵巢癌細胞間的連接狀態(tài)， NG

9、F/NGFRs的抑制劑能阻斷這種作用。結果表明：NGF/NGFRs能通過調節(jié)卵巢癌細胞間的緊密連接狀態(tài)而參與卵巢癌細胞成團、運動能力的調節(jié)。
　?、芸疾霳GF/NGFRs對卵巢癌細胞遷移能力的影響及分子機制。利用Transwell小室及本實驗室自行構建的微流控芯片考察NGF對卵巢癌細胞遷移行為的影響；通過定量RT-PCR、Western blot法檢測NGF對WNT/β-catenin信號通路中的關鍵因子β-catenin及下游靶

10、基因CD44、C-myc、MMP2、MMP7、TIMP2等表達的影響，考察NGF影響卵巢癌細胞遷移能力變化的分子機制。結果顯示：不管是在二維培養(yǎng)還是三維培養(yǎng)條件下，NGF均能影響CAOV3和OVCAR3的遷移能力；NGF對經典WNT/β-catenin信號中的關鍵分子及下游靶基因的表達有影響，NGF可通過激活或調控WNT/β-catenin信號通路影響卵巢癌細胞的遷移。NGF對不同卵巢癌細胞遷移變化的影響有一定的差異性，說明NGF對卵巢

11、癌細胞的生物學效應有細胞特異性。
　　綜上所述，得出以下結論：NGF/NGFRs在選擇的這幾種上皮性卵巢癌細胞系中均表達；NGF能調節(jié)卵巢癌細胞的存活、生長、凋亡相關基因的表達水平，影響卵巢細胞的周期和生長節(jié)律；NGF能調節(jié)卵巢癌細胞中緊密連接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4的表達，影響卵巢癌細胞之間的連接狀態(tài)，參與卵巢癌細胞的轉移過程；NGF可通過經典的WNT/β-catenin信號通路介導卵巢癌細胞的遷移行為。以上實驗結