人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及生物學(xué)特性研究.pdf

1、第一章人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:
　　建立一種簡(jiǎn)單可行的人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、分離、培養(yǎng)方法。
　　方法:
　　通過人嗅黏膜組織貼壁法體外分離、培養(yǎng)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞，在倒插顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué);用流式細(xì)胞儀檢測(cè)及觀察其細(xì)胞表面標(biāo)記物;再在體外誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞，應(yīng)用油紅O染色、茜素紅染色分別鑒定脂肪組織脂滴和骨組織鈣鹽沉積。
　　結(jié)果:
　　體外培養(yǎng)的人嗅黏膜

2、間充質(zhì)干細(xì)胞在形態(tài)上以梭形為主，細(xì)胞排列呈放射狀，細(xì)胞增殖迅速。間充質(zhì)干細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記物CD73、CD90、CD105人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞高表達(dá)，造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD45不表達(dá)。在特定條件下可定向誘導(dǎo)分化為脂肪組織、骨組織。免疫熒光染色提示，所培養(yǎng)的人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)Nestin和STRO-1。
　　結(jié)論:
　　人嗅黏膜組織塊貼壁培養(yǎng)法是一種操作簡(jiǎn)便的有效的方法，通過此方法培養(yǎng)出的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的一般鑒定

3、標(biāo)準(zhǔn)，表達(dá)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物Nestin、STRO-1。
　　第二章人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究
　　目的:
　　全面了解人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　方法:
　　1.人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞，分離、純化、培養(yǎng)、傳代（方法同第一章）;
　　2.透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu);
　　3.加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM/F12培養(yǎng)基+2％ B27+20μg/L的

4、表皮生長(zhǎng)因子+20μg/L的堿性成纖維生長(zhǎng)因子）觀察嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞成球特性;
　　4.為進(jìn)一步了解其生長(zhǎng)特性，采用MTT法測(cè)定并繪制出嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線;
　　5.流式細(xì)胞儀測(cè)定并分析其細(xì)胞周期;
　　6.在體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)元分化，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色、western blot、電鏡及膜片鉗等方法鑒定誘導(dǎo)后的細(xì)胞神經(jīng)元β-微管蛋白(β-tubulin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)微管相關(guān)蛋白-2(

5、MAP-2)的表達(dá)，觀察分化后的細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞電生理特性。
　　結(jié)果:
　　嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示:細(xì)胞表面有許多的微絨毛，可有兩種不同的細(xì)胞形態(tài);具有成球特性且表達(dá)Nestin，生長(zhǎng)曲線結(jié)果提示人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞符合干細(xì)胞正常生長(zhǎng)特征且細(xì)胞增殖較活躍;流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)表明，嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞有80％以上細(xì)胞處于GO-G1期;神經(jīng)元特定誘導(dǎo)后，嗅黏膜間充質(zhì)于細(xì)胞高表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物MAP-2、tubu