人FGF8b蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:通過昆蟲桿狀病毒載體表達系統(tǒng)表達重組人成纖維細胞生長因子-8b(FGF-8b)，優(yōu)化表達條件，純化后研究其對1-甲基4-苯基吡啶(MPP+)誘導(dǎo)建立的帕金森(Parkinson disease，PD)病細胞模型的保護作用及其抗凋亡機制。
　　方法:目的基因FGF8b和轉(zhuǎn)移載體pFastbac雙酶切后連接，連接產(chǎn)物pFastbac-FGF8b鑒定后進一步轉(zhuǎn)化至DH10Bac感受態(tài)細胞，目的基因同源轉(zhuǎn)座至Bacmid中，通過藍白

2、斑實驗重復(fù)篩選獲得高純度穿梭載體Bacmid-FGF8b。重組陽性質(zhì)粒通過脂質(zhì)體包裝后轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞，收獲的病毒重復(fù)轉(zhuǎn)染擴大病毒滴度。收獲的蛋白用SDS-PAGE，Western blot進行鑒定。為了提高蛋白產(chǎn)量，分別對病毒侵染時間和侵染病毒滴度進行探索優(yōu)化。在最佳表達條件下收獲細胞沉淀超聲破碎后通過肝素親和層析柱純化獲得目的蛋白FGF8b。NIH3T3細胞檢測蛋白促增殖作用。為了研究FGF8b的神經(jīng)保護作用，利用MPP+誘導(dǎo)PC

3、-12細胞建立帕金森細胞模型檢測其促增殖和抗凋亡作用，并進一步通過實時定量PCR和Western blot確定其抗凋亡作用機制。
　　結(jié)果:人FGF8b成功在昆蟲細胞中表達，肝素純化后蛋白純度＞90％，蛋白產(chǎn)量為2.78mg/L。細胞活性檢測證實純化的重組蛋白能顯著促進NIH3T3細胞生長，在0.5 ng/ml～64ng/ml之間呈劑量依賴性。FGF8b對帕金森細胞模型有保護作用，并且FGF8b通過與FGFR3結(jié)合降低MPP+誘導(dǎo)