不同鎮(zhèn)痛藥對肝癌細胞生物學行為影響及其機制的研究.pdf

1、第一章不同鎮(zhèn)痛藥對肝癌細胞生物學行為影響
　　目的：探討不同鎮(zhèn)痛藥（嗎啡、布洛芬、塞來昔布、氯胺酮）對肝癌細胞生物學行為影響。
　　方法：人肝癌QGY-7703細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別接種于培養(yǎng)板或25cm2培養(yǎng)瓶中。采用隨機數(shù)字表法，將兩種細胞分別隨機分為13組(n=6)：不同濃度布洛芬組(IB1-3組)布洛芬終濃度分別為250 umol/L、500 umol/L、1000umol/L；塞來昔布組(CE1-3組):塞來昔

2、布終濃度分別為25umol/L、50umol/L、100umol/L；嗎啡組(MO1-3組)：嗎啡組終濃度分別為0.01umol/L、10umol/L、1000umol/L；氯胺酮組(KE1-3組):氯胺酮終濃度分別為100umol/L、500umol/L、1000umol/L；以及正常對照組(C組)：加入等容量的RPM-l640培養(yǎng)基。分別于孵育24、48和72h時，采用cck-8法測定各組細胞增殖抑制率。于孵育48h后，用流式細胞術(shù)

3、檢測各組細胞凋亡率及其周期情況；采用利用Transwell小室檢測各組細胞的侵襲和遷移能力。
　　結(jié)果：與C組比較，IB1-3組、CE1-3組、MO1-3組和KE1-3組等十二組細胞的增殖抑制率均依次升高，且依照藥物作用的濃度和時間的增加而依次升高，具有濃度和時間的依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與C組比較，IB1-3組、CE1-3組、MO1-3組和KE1-3組等十二組細胞遷移和侵襲能力均降低，且依照藥物作用的濃度的增加

4、而依次降低，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與C組比較，IB1-3組、CE1-3組、MO1-3組和KE1-3組等十二組細胞凋亡率均增加，且依照藥物作用的濃度增加而依次增加，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與C組比較，IB1-3組、CE1-3組和MO1-3組等九組細胞的G1期細胞百分比均升高，S期和M期細胞百分比均降低，且依照藥物作用濃度的增加而依次變化，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

5、；KE1-3組細胞的G1期和S期細胞百分比均升高，M期細胞百分比均降低，且依照藥物作用的濃度的增加而依次變化，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論布洛芬、塞來昔布、嗎啡和氯胺酮均可以抑制人肝癌QGY-7703細胞的增殖，并可降低肝癌QGY-7703細胞的侵襲和遷移的能力，可能與其促進細胞的凋亡并使細胞周期發(fā)生阻滯有關。
　　第二章布洛芬抑制肝癌細胞生長的機制研究
　　目的：探討PI3K/Akt/

6、mTOR通路和IKKβ/IκBα/NF-κB通路在布洛芬抑制肝癌細胞生長中的作用。
　　方法:取對數(shù)生長期人肝癌細胞QGY-7703，采用隨機分為兩組，對照組（C組）:加入等容量的RPM-l640培養(yǎng)基；實驗組（IB組）：按照不同布洛芬作用濃度分為三個亞組：IB1組（布洛芬作用濃度為250umol/L），IB2組（布洛芬作用濃度為500umol/L）、IB3組（布洛芬作用濃度為1000umol/L）。各組分別作用48后，采用Rea

7、l-TimePCR測各組細胞中IKKβ、Bcl-2、PI3K、PTEN和MMP-9基因表達的變化。用Western blot檢測各組細胞中PI3K/Akt/mTOR信號通路和IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路相關蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1. PI3K/Akt/mTOR信號通路相關因子
　　與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細胞PTEN mRNA和PTEN蛋白表達明顯升高，且隨著布洛芬作用濃度的增加依

8、此升高，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細胞PI3K mRNA、Akt蛋白和mTOR蛋白的表達量均無明顯差異(P＞0.05)；與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組等三組細胞MMP-9 mRNA和MMP-9蛋白的表達以及 p-Akt、p-mTOR蛋白的表達均顯著下降，且隨著布洛芬作用濃度的增加依此降低，具有良好的濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.

9、IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路相關相關因子表達的結(jié)果
　　與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細胞IKKβmRNA和Bcl-2mRNA表達明顯下調(diào)，且依照布洛芬作用濃度的增加而依次下調(diào)，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與C組比較，IB1組、IB2組、IB3組三組細胞IKKβ、Bcl-2、p-IKKβ、p-IκBα和NF-κBp65蛋白的表達明顯下調(diào)，且隨著布洛芬作用濃度的增加依此降低，具有良好的濃

10、度依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：布洛芬對QGY-7703細胞生長的抑制可能與其對細胞PI3K/Akt/mTOR和IKKβ/IκBα/NF-κB信號通路的調(diào)控有關。
　　第三章鎮(zhèn)痛藥物處理后肝癌QGY-7703細胞差異表達基因的篩選
　　目的:探究鎮(zhèn)痛藥（塞來昔布、嗎啡和氯胺酮）抑制肝癌QGY-7703細胞生長的機制
　　方法:取對數(shù)生長期的細胞，采用隨機數(shù)字表法，將細胞隨機分為4組(n=3

11、)：QGY-7703細胞分為：塞來昔布組(CE組):塞來昔布作用濃度為50umol/L；嗎啡組(MO組)：嗎啡作用濃度為10 umol/L；氯胺酮組(KE組):氯胺酮作用濃度為500umol/L；對照組(C組)加入等容量的RPM-l640培養(yǎng)基。各組培養(yǎng)48h后，采用全基因組表達譜芯片,篩查鎮(zhèn)痛藥物（塞來昔布、氯胺酮和嗎啡）處理后QGY-7703細胞差異表達基因,并進行生物信息學功能和通路分析。
　　結(jié)果：與C組相比，在CE組細胞

12、中有141個基因表達增加，50個基因表達下降；而在KE組中有1032個基因表達增加，899個基因表達下降；而在MO組中有766個基因表達上升，311個基因表達下降。其中KE組和CE組兩組共同調(diào)控基因有34個； KE組和MO組兩組共同調(diào)控基因195個；MO組和CE組兩組共同調(diào)控18基因個；KE組、CE組和MO組三組共同調(diào)控基因17個。
　　生物學通路分析顯示：與C組相比，CE組差異基因主要涉及應急、細胞的負性調(diào)節(jié)、生物大分子代謝等方

13、面，參與PPAR信號通路、MAPK信號通路、mTOR信號通路等的改變；KE組差異基因主要涉及細胞周期、RNA的代謝等方面，參與溶酶體、基因的剪接與復制相關通路和P53信號通路等通路的改變；MO組差異基因主要涉及生物代謝、轉(zhuǎn)運、RNA的代謝等方面，參與抗原的加工和提呈、自然殺傷細胞介導的細胞毒性等相關通路、MAPK信號通路等通路的改變
　　結(jié)論：本研究成功篩選出鎮(zhèn)痛藥（塞來昔布、嗎啡和氯胺酮）處理后人肝癌QGY-7703細胞差異表達