酵母線粒體β-酮酰-ACP還原酶的結(jié)構(gòu)生物學研究.pdf

1、脂肪酸是自然界中極為重要的一類疏水性分子，在細胞內(nèi)扮演著多種多樣的角色。細菌、植物和動物細胞內(nèi)都擁有各自的脂肪酸合成體系，負責以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A作為原料的從頭合成。有兩種類型的合成酶系統(tǒng)，Ⅰ型脂肪酸合成酶存在于脊椎動物、酵母細胞質(zhì)基質(zhì)以及一些細菌中，該酶只含一條或者兩條龐大的多個結(jié)構(gòu)域的多功能肽鏈。Ⅱ型脂肪酸合成酶存在于植物和大多數(shù)細菌中，是由不同基因編碼多種不同的酶參與整個合成反應(yīng)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母線粒體中存在著Ⅱ型

2、脂肪酸合酶。而針對該條合成代謝中各個反應(yīng)來說，共計有六種基因參與編碼這些酶，分別是ACP1，CEM1，MCT1，HTD2，ETR1和OAR1。其中OAR1基因負責編碼線粒體β-酮酰-ACP還原酶(YmtOAR1)，研究表明刪除酵母細胞中的該基因直接導致呼吸缺陷型表型及生長的抑制。此外，線粒體中的脂肪酸合成體系被證明與tRNA的加工過程息息相關(guān)。
　　 YmtOAR1屬于SDR(short-chain alcohol dehydr

3、ogenase)蛋白家族，與其他物種的同源蛋白(FabG)存在20％-30％的同源性。但不同的是，一級序列中的插入序列及C-末端的缺失，導致了整體結(jié)構(gòu)并沒有呈現(xiàn)經(jīng)典的Rossmann折疊花樣，在溶液中呈現(xiàn)獨特的二聚體聚合狀態(tài)。YmtOAR1以輔酶NADPH作為負氫供體，通過質(zhì)子傳遞，催化底物還原。本論文的研究工作解析了2.6(A)分辨率的apo-YmtOAR1晶體結(jié)構(gòu)以及兩套含有輔酶NADPH復合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，YmtOAR

4、1與所有已報道的同源蛋白有著明顯的結(jié)構(gòu)差異;且這種差異也從一定角度闡明了聚集狀態(tài)與同源蛋白不同的原因。同時，YmtOAR1在結(jié)合輔酶后的構(gòu)象發(fā)生了較為顯著的變化，并且兩套含配體的復合物晶體結(jié)構(gòu)顯示NADPH的構(gòu)象亦略有不同。三套晶體結(jié)構(gòu)可以用來模擬輔酶進入酶活口袋的動態(tài)過程。此外，在結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，通過定點突變和酶活性檢測，確定了輔酶識別的關(guān)鍵殘基Arg14，該殘基對于輔酶識別酶是極其重要的，該殘基的突變直接導致酶活性的喪失和極大地降

5、低了酶對輔因子的親和力。對于YmtOAR1的結(jié)構(gòu)解析無疑拓展了我們對SDR家族蛋白豐富性的進一步認識，同時對更深入理解酶促反應(yīng)機制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 真核生物的內(nèi)膜系統(tǒng)極為發(fā)達，不但區(qū)分了各種生化反應(yīng)所發(fā)生的場所，也提供了各種細胞器之間的物質(zhì)交流模式——囊泡運輸。轉(zhuǎn)運囊泡包裹貨物分子，在一些特殊蛋白的輔助下，與特定的靶膜融合，從而完成對貨物分子的篩選和運輸。在SNARE和Sorting Nexins這兩種蛋白家族的協(xié)助下，囊

6、泡經(jīng)過出芽或融合，后經(jīng)分揀和運輸，抵達靶位點。
　　 存在于釀酒酵母細胞高爾基體到晚期溶酶體分揀途徑中的重要蛋白Mvp1，是一個較為特殊的Sorting Nexins蛋白。MVP1基因與VPS1基因存在一定的聯(lián)系性，過量表達Mvp1蛋白可抑制VPS1的幾個等位基因。關(guān)于Mvp1蛋白參與囊泡分揀過程的機制目前還未闡明。本項研究結(jié)晶了Mvp1蛋白部分片段（⊿N117-Mvp1），嘗試解析晶體結(jié)構(gòu)，但由于衍射分辨率較低，故相應(yīng)的優(yōu)化工