簡介：目的研究2000～2011年引起青海省麻疹流行的麻疹病毒的基因型特征，分析麻疹病毒的來源、傳播和基因分布，進一步累積并豐富青海省本土流行的麻疹病毒的基因和氨基酸變異資料，并及時發(fā)現(xiàn)可能的輸入病毒，為該地區(qū)進一步控制和消除麻疹提供科學依據。方法使用淋巴信號激活因子轉染的非洲綠猴腎細胞（VEROSLAM細胞）對麻疹疑似病例的咽拭子和或尿標本進行病毒分離。經逆轉錄，聚合酶鏈反應REVERSETRANPOLYMERASECHAINREACTION，RTPCR方法對分離的麻疹病毒進行N基因羧基CARBOXYL，COOH末端676個核苷酸片段的擴增。通過對上述RTPCR擴增產物進行核苷酸序列測定和分析，以N基因COOH末端450個核苷酸序列片段構建基因親緣性關系樹，并進行核苷酸和氨基酸同源性分析，分析與疫苗株S191、中國麻疹HLA代表株CHINA9322N蛋白羧基末端150個氨基酸的變異及2000～2011年麻疹流行株間N蛋白羧基末端150個氨基酸的變異。結果青海省2000～2011年分離的19株麻疹野病毒，均為HL基因型中的HLA基因亞型。19株HLA基因亞型麻疹野病毒N基因COOH末端序列分析結果顯示，它們之間的核苷酸同源性為960％～100％，氨基酸同源性為927％～100％與HLA基因型代表株CHIN9322的核苷酸同源性為971％～995％，氨基酸同源性為940％～993％以中國麻疹疫苗株S191為基準，青海省2000～2011年分離到的19株麻疹病毒共有32個氨基酸發(fā)生置換，置換率為213％32150，有16個氨基酸位點全部發(fā)生變異，有16個位點為部分氨基酸變異；青海省2000～2011年分離到的19株麻疹病毒與中國麻疹HLA代表株CHINA9322的氨基酸差異為1～8個，2009～2011年的10株麻疹病毒與CHINA9322的氨基酸差異明顯增多；與2000～2005年的麻疹病毒流行株相比，2009～2011年的麻疹病毒N蛋白基因序列推導的氨基酸均有共同的3個氨基酸變化，在422位點由甘氨酸G變異為絲氨酸S，在457位點由S變異為G，在497位點由精氨酸R變異為賴氨酸K。結論青海省2000～2011年流行的麻疹野病毒仍以本土基因亞型HLA為絕對優(yōu)勢基因亞型，未發(fā)現(xiàn)HLB和HLC亞型；2000～2005年分離到的的麻疹病毒在同一小分支，形成傳播鏈120092011年分離到的麻疹病毒在另一小分支，形成傳播鏈2。隨著年份增加，19株麻疹病毒與中國麻疹疫苗株S191和中國麻疹HLA代表株CHINA9322之間的氨基酸差異呈現(xiàn)增加趨勢。2009～2011年的麻疹病毒N蛋白基因序列推導的氨基酸均有共同的3個氨基酸變異，提示應關注N蛋白氨基酸變異狀況及變化趨勢。

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簡介：點擊查看更多2005~2011年青島地區(qū)流感病毒監(jiān)測與分子流行病學研究.pdf精彩內容。

簡介：本文對基于腺病毒載體的新型流感疫苗研究及人群中腺病毒、腸病毒的血清流行病學進行了研究。本研究分為兩個部分第一部分基于腺病毒載體的新型流感疫苗研究。流感病毒是引起流行性感冒的主要病原體。血凝素是流感病毒表面免疫原性最強的抗原成分刺激機體產生保護性中和抗體因此血凝素作為免疫原被應用于新型通用型流感疫苗的研究。重組腺病毒作為一種重要的基因表達載體具有高表達、可同時誘導特異性體液免疫和細胞免疫、安全性好、易于制備等優(yōu)點。人5型腺病毒HUMANADENOVIRUSTYPE5ADHU5曾被廣泛應用于各種疫苗研究但人群中普遍存在ADHU5的預存中和抗體使ADHU5作為疫苗載體的臨床應用受限。為克服預存中和抗體的影響稀有人血清型或來自于其它種屬的腺病毒被發(fā)展為新型疫苗載體。源于黑猩猩的腺病毒在人群中的血清陽性率較低免疫原性強被證明是一種理想的疫苗載體。以腺病毒黑猩猩血清型68CHIMPANZEEADENOVIRUSTYPE68ADC68載體為平臺將多種不同亞型的流感病毒HA基因克隆至該腺病毒載體構建成表達不同HA的重組腺病毒庫以此作為新型流感疫苗并研究其免疫反應及免疫保護效果。通過分子克隆手段我們將H1N1、H2N2、H3N2、H4N2、H5N1、H6N6、H7N2、H9N2及H7N9等流感病毒的HA基因分別克隆至ADC68載體并獲得相應的重組腺病毒。表達H7N9HA的重組腺病毒免疫小鼠后顯示該疫苗成功誘導小鼠產生血凝抑制抗體和針對H7N9HA的特異性抗體分型抗體檢測顯示可誘導高滴度的IGG2B。因此基于重組腺病毒載體的流感疫苗可刺激小鼠產生特異性體液免疫和細胞免疫。第二部分中國健康成人中腸病毒和腺病毒的血清流行病學調查。近年來手足口病HFOOTMOUTHDISEASEHFMD成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。腸病毒71ENTEROVIRUS71EV71和柯薩奇病毒16COXSACKIEVIRUS16CA16是引起手足口病的主要病原體。這兩種病毒主要感染7歲以下兒童但也有成人感染而致病。另外在有些地方腺病毒和腸病毒共感染成為手足口病另一致病因素。因此我們調查中國健康成人血清中針對腸病毒和腺病毒的中和抗體的流行情況以探討這些病毒的流行趨勢以及人群的免疫力。我們共收集了391份健康成人血清通過微量中和試驗檢測血清中針對EV71、CA16、人腺病毒5型ADENOVIRUSHUMANSEROTYPE5ADHU5和黑猩猩腺病毒7型CHIMPANZEEADENOVIRUSPAN7ADC7病毒的中和抗體滴度。結果顯示EV71、CA16、ADHU5三種病毒在人群中的陽性率較高分別為857％、588％和742％。三種病毒都為陽性的血清陽性率為394％154391其中各病毒中和抗體滴度的中位數分別為80、40和640。分析發(fā)現(xiàn)EV71中和抗體效價與CA16、ADHU5有一定的相關性。ADC7在人群中的血清陽性率較低為118％。由于人群中針對ADC7的預存免疫較低提示ADC7可以作為一種理想的疫苗載體。

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簡介：研究背景、目的、意義人類杯狀病毒HUMANCALICIVIRUS，HUCV包括諾瓦克樣病毒NOVIRUS，NVSNWALKLIKEVIRUS，NLVS和扎幌樣病毒SAPPOVIRUS，SVSSAPPOLIKEVIRUS，SLVS，是導致人類急性胃腸炎的常見病原體，也是僅次于輪狀病毒導致兒童急性腹瀉的重要病原體。NLVS與SLVS分別是在1968年、1977年的美國俄亥俄州的NWALK地區(qū)及日本扎幌地區(qū)發(fā)現(xiàn)的。此后，在世界多個國家均檢測到此兩類病毒，NLVS又曾被稱為小RNA病毒、小圓結構病毒。1998年國際病毒分類委員會根據病毒形態(tài)、結構、抗原特性、基因序列和遺傳進化分析等研究成果，將此兩類病毒歸入杯狀病毒科。HUCV毒株間具有很大的核苷酸序列多樣性，依據基因結構中RNA多聚酶及殼蛋白區(qū)域序列的差異，將NLVS分為三個遺傳組GEICGROUP，每一遺傳組又分別包括多個不同的群CLUSTER。SLVS分為三個基因型，五個基因亞型。FARKAS等最近研究表明，SLVS存在更多的基因型與基因亞型，表明了HUCV基因的多樣性。長期以來，由于檢測方法的局限，對HUCV給人類造成的危害及其嚴重程度缺乏正確的認識，常常低估其危害。1992年以美籍學者JIANGXI為首的研究組建立并發(fā)展了RTPCR方法檢測HUCV后，HUCV所致疾病的危害性和嚴重性越來越被研究者重視。HUCV呈全球流行趨勢，已成為人類非菌性急性胃腸炎暴發(fā)和散發(fā)的最主要原因之一。在1997年7月2000年6月美國發(fā)生的233起非菌性急性胃腸炎的暴發(fā)中確認其中的93％是由NLVS所致。在芬蘭2398名224月齡兒童為期兩年的前瞻性非菌性急性胃腸炎病原學研究中發(fā)現(xiàn)HUCV的檢出率為29％，與輪狀病毒的檢出率一致。在荷蘭1998年12月至1999年12月進行的隊列研究表明腹瀉患者中HUCV陽性率為17％。我國對于HUCV的研究則起步較晚，最早是方肇寅等在19901991年我國河南急性腹瀉門診收集的腹瀉患兒糞便中檢出兩例NLVS。之后，在我國的北京、長春、河北、廣州等地區(qū)均檢測出HUCV，其陽性率分別為249％、16％、316％、91％。最近資料顯示2003年秋冬季在廣州的中學、小學、幼兒園均發(fā)生了NLVS胃腸炎的暴發(fā)。這些研究資料表明我國HUCV的感染已非常普遍，是僅次于輪狀病毒導致兒童腹瀉的病原體，并且NLV所引起急性胃腸炎的暴發(fā)也已較多見。綜上所述，HUCV引起的感染在我國北方已非常普遍，在我國南方廣州也已檢測到NLVS的存在，并且導致了多起急性胃腸炎的暴發(fā)，但目前，國內研究主要側重病原、抗體的檢測，故有關結果缺乏系統(tǒng)、全面和代表性，同時也缺乏其它流行病學及臨床有關資料。因此，本研究擬在明確廣州地區(qū)存在HUCV感染的基礎上進一步研究HUCV感染的分布特征、感染頻率、流行毒株的分子生物學特點、主要臨床特點及危險因素，為檢測試劑的開發(fā)、有效疫苗的研制等研究打下基礎和創(chuàng)造條件。研究結果將為人們更清楚、更明確的認識HUCV感染的危害性和嚴重性提供信息，為廣州地區(qū)制定有針對性的防治對策奠定理論依據，同時也豐富了我國對HUCV感染的有關理論和信息。因此，開展本研究具有現(xiàn)實意義和緊迫性。研究方法收集南方醫(yī)院兒科門診及病房臨床診斷為病毒性腹瀉患兒的糞便標本，并同時進行調查，填寫調查表，電話隨訪完善調查表。對收集的標本采用ELISA檢測輪狀病毒RV，檢測RV陰性標本采用RTPCR檢測NLVS，RV及NLVS均為陰性標本采用RTPCR檢測SLVS。隨機抽取部分檢測HUCV陽性標本進行純化、測序，并采用DNASTAR、TREEVIEW等軟件進行序列分析、繪制進化樹。對調查表資料用統(tǒng)計軟件包SPSS100建立數據庫，采用11配對病例NLVS一病例RV比較研究及11配對病例對照研究分析NLVS感染的臨床特點及危險因素。對于NLVS病例與輪狀病毒病例的對比研究采用X2檢驗、T檢驗，對于危險因素分析采用11單因素及多因素條件LOGISTIC回歸分析。研究結果1在2003年10月2004年1月及2004年10月2005年1月兩階段共收集到腹瀉患兒糞便標本648份。檢測出輪狀病毒陽性標本339份，陽性率5231％339648，NLVS陽性標本80份，陽性率1235％80648，SLVS陽性標本2份，陽性率087％2229。本次研究的四個月中NLVS均有較高的陽性率，分別為1174％10月、1416％11月、909％12月、1395％1月，各月陽性率經X2檢驗無顯著性差異，但2004年10月比2003年10月NLVS檢出率要高X2檢驗，P＜005。本研究中NLVS腹瀉患兒主要分布于2歲以下占檢測陽性數的8875％，其中又以6月12月、1歲2歲兩組陽性率最高共占7875％，年齡最小為25天，最大為4歲半。NLVS陽性患兒性別分布存在著明顯差異，但這種差異的原因是由于總體腹瀉患兒性別比例的差異所導致。兩例扎幌樣病毒陽性患兒分別為11月女孩、2歲半男孩。2隨機抽取22株NLVS進行測序分析，結果有6株屬于GⅡ3群，15株屬于GⅡ4群，1株尚不能確定其所屬群。在2003年GⅡ3群、GⅡ4群相當各為5株，而2004年以GⅡ4群為主10株GⅡ4，僅有1株GⅡ3。在測序的22株NLVS中無GⅠ型NLVS。兩株SLVS經測序分析，均屬于GⅠ1群。3NLVS感染性腹瀉的主要癥狀為嘔吐、腹瀉、發(fā)熱。其臨床特征有別于RV感染性腹瀉，前者嘔吐癥狀最早出現(xiàn)者居多6282％，并且有嘔吐癥狀者要多于后者分別為8462％、6795％，X2檢驗，P＜005。而RV腹瀉患兒最早出現(xiàn)的癥狀以腹瀉為主6538％。發(fā)熱、最高溫度、發(fā)熱天數、腹瀉天數、是否輸液治療及就診次數六項均是RV感染患兒高于NLVS感染患兒，說明總體上RV腹瀉患兒臨床癥狀比NLVS腹瀉患兒臨床癥狀較嚴重。但NLVS感染性腹瀉所造成的家庭經濟負擔不容忽視，直接花費平均約為415元。NLVS與RV腹瀉患兒感染的可能危險因素比較，結果各項均無顯著性差異。對NLVS感染性腹瀉可能的危險因素進行單因素及多因素條件LOGISTIC回歸分析，結果最終篩選出4項危險因素，分別是吃生冷食品、與腹瀉患者接觸、吮手習慣及較少洗手。同時還對RV感染的危險因素進行了對比研究，結果證實RV與NLVS具有相同的危險因素。結論證實NLVS是引起廣州地區(qū)兒童秋冬季腹瀉的重要病原體，具有較高的發(fā)病率，并且我國南方地區(qū)發(fā)病高峰期可能早于北方地區(qū)；HUCV導致兒童腹瀉發(fā)生的年齡較小，主要分布于2歲以下；GⅡ3群、GⅡ4群均是廣州秋冬季的流行優(yōu)勢株，但在不同的時間段可能存在不同的流行優(yōu)勢株，GⅠ型NLVS在本地的流行居次要位置；證實廣州地區(qū)存在SLVS引起的腹瀉，但流行季節(jié)尚不能確定；兩株SLVS基因型與我國北方檢出的一株SLVS基因型不同，說明我國存在著不同基因型的SLVS，并且不同的地區(qū)可能存在的SLVS基因型也不相同。NLVS感染性腹瀉的臨床特征不同于RV感染性腹瀉；RV感染性腹瀉臨床癥狀要比NLVS感染性腹瀉嚴重，但NLVS感染性腹瀉所造成的家庭經濟負擔不容忽視；NLVS與RV感染性腹瀉具有相同的危險因素。NLVS危險因素的研究對制定NLVS急性胃腸炎的預防措施提供了參考依據。對NLVS感染性腹瀉的臨床特征和危險因素研究在我國尚屬首次。

簡介：中國醫(yī)科大學博士學位論文沈陽地區(qū)鼻及咽部非霍奇金淋巴瘤臨床病理、EB病毒相關性及細胞遺傳學研究姓名何艷姣申請學位級別博士專業(yè)病理學與病理生理學指導教師賈心善20050301‘～●。●●?！馹●。一中文論著摘要、～，。，～，沈陽地區(qū)鼻及咽部非霍奇金淋巴瘤I瞄床病理、EB病毒相關性及細胞遺傳學研究前言及目的鼻及咽部為結外淋巴瘤常見的發(fā)生部位，僅次于胃腸道。我國的結外淋巴瘤以鼻及咽部非霍奇金淋巴瘤多見，尤其以鼻NK／T細胞淋巴瘤為甚。鼻NK／T細胞淋巴瘤是發(fā)生于鼻及面部中線的進行性破壞性損害的疾病，以往曾命名為壞死性肉芽腫、惡性肉芽腫、中線惡性網織細胞增生癥MMR、多形性網織細胞增生癥PMR及致死性中線肉芽腫LMG等。T994年10月在香港召開的鼻及淋巴結外血管中心性淋巴瘤的國際學術研討會上，JAFFE等首次命名鼻NK／T細胞淋巴瘤，WHO淋巴造血組織腫瘤新分類中正式列出了NK／T細胞淋巴瘤。該腫瘤在亞洲及南美洲地區(qū)發(fā)病率較高，而在西歐和北美地區(qū)則很少見到，目前已成為國內外的研究熱點。EPSTEINBARR病毒EBV是一種廣泛存在于人類中的線性雙鏈DNA／皰疹病毒，感染人體后，可引起多種改變。自1964年EPSTEINMA在BURKITT淋巴瘤細胞系中首先發(fā)現(xiàn)EPSTEINBARR病毒EBV以來，已證明其是傳染性單核細胞增多癥的病原體，并在鼻咽癌、霍奇金氏病HD、非霍奇金氏淋巴瘤NHL、免疫抑制個體的淋巴增生性疾病等組織中先后檢測出EB病毒，并認為這些疾病的發(fā)生與EB病毒有關。近來～些研究資料顯示，EB病毒與鼻及咽部NK／T細胞淋巴瘤有一定相關性。P53基因是近年來研究較多的一種腫瘤抑制基因，它位于染色體17P13，分為野生型和突變型兩種。野生型P53參與了DNA損傷修復、細胞周期調控、細胞凋亡及抑制血管生成等過程。P53基因的突變使上述功能喪失，從而導致腫瘤的形成。P53基因的缺失或突變被認為與人類50％～60％的腫瘤有關。母一連環(huán)素BCATENIN是一種多功能細胞漿內的可溶性蛋白，它是承擔WNT信號向細胞內傳遞致使細胞增殖的中間分子，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展上起重要作用；同時它作為細胞聞粘附結構上皮鈣粘素一連

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簡介：A型流感病毒INFLUENZAAVIRUS屬于正粘病毒科為單股負鏈RNA病毒其基因組由8個節(jié)段組成編碼11種蛋白質。它能引起急性呼吸道傳染病具有傳染性強發(fā)病率高容易引起流行或大流行等特點。A型流感病毒是重要的人畜共患病病原人畜共患的特征使其有產生大流行的潛力。20世紀至今先后爆發(fā)了多次全球性大流感對人類的生命健康和社會生活形成了巨大的威脅。NS1NONSTRUCTURALPROTEIN1是A型流感病毒的非結構蛋白是一種多功能調節(jié)蛋白在調節(jié)流感病毒的致病性及毒力方面發(fā)揮著重要作用。NS1蛋白從病毒和宿主兩個方面來調節(jié)病毒的致病性和毒力。在病毒方面NS1蛋白可以通過增強病毒MRNA的翻譯來提高病毒的復制從而直接增強病毒抵抗宿主的抗病毒反應的能力在宿主方面NS1蛋白可以通過抑制宿主細胞蛋白的合成、拮抗干擾素的產生以及誘導細胞凋亡等方式調節(jié)機體的抗病毒反應間接地增強病毒的致病性。NS1蛋白的這些功能依賴于其非特異性地與雙鏈RNADSRNA和特異性地與目標蛋白結合的能力。NS1蛋白之所以是一個多功能蛋白是因為蛋白上存在多個功能位點這些功能位點又與結構相對應即結構是功能的基礎。解析NS1蛋白的三維結構具有重要意義能夠進一步解釋它的生物學功能并對相關的藥物設計起指導作用。本論文采用原核表達系統(tǒng)大量表達可溶的NS1蛋白運用親和層析、凝膠過濾層析等手段純化蛋白通過篩選以及優(yōu)化蛋白質的結晶條件成功得到NSL蛋白的晶體。全長NS1蛋白三維結構的解析有助于我們對NS1生理功能的理解并對抗流感病毒藥物的設計具有重要的指導作用。

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簡介：急性上呼吸道感染是指鼻腔、咽或喉部急性炎癥的概稱，是呼吸道最常見的一種傳染病。本病約有70～80％由病毒引起，主要有流感病毒甲、乙、丙、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、?？刹《尽⒖滤_奇病毒、麻疹病毒、風疹病毒等，成人以鼻病毒為主，兒童則以副流感病毒和呼吸道合胞病毒為主。本病在祖國醫(yī)學中歸屬于“外感發(fā)熱”、“傷風感冒”范疇。內經、傷寒論、及后世醫(yī)家，如劉完素、葉天士、吳鞠通等都本病有詳細的論述，并已形成較為完備的外感熱病理論體系。一般認為，該病的病因為“六淫”，即“風、寒、暑、濕、燥、火”，八綱病機、臟腑病機、六經病機、衛(wèi)氣營血病機、三焦病機對此皆有詳實的記載。本課題通過對急性病毒性上呼吸道感染患者的中醫(yī)四診證候、發(fā)病節(jié)氣、結合血常規(guī)和血清病毒抗體檢測，探討中醫(yī)證候分型與血常規(guī)、病毒種類的相關性。目的運用臨床流行病學、數據統(tǒng)計方法及實驗室檢測技術，結合地域、季節(jié)、年齡等多因素，探討急性病毒性上呼吸道感染的中醫(yī)證候，為特定病毒感染的中醫(yī)急性上呼吸道感染辨證論治提供客觀、相對定量的診斷標準。為中醫(yī)外感熱病的系統(tǒng)研究、中醫(yī)防治急性上呼吸道感染的流行、治療、預后提供客觀依據。方法采用前瞻性研究方法，對20069至20072前來我院急診門診和留觀的急性上呼吸道感染的病人進行中醫(yī)四診辨證登記、病毒檢查以及隨訪。病毒檢查采用歐蒙試劑盒，免疫熒光法進行。結果179例納入病例根據中醫(yī)四診證候，通過聚類分析，可得出聚Ⅳ類風寒證，風熱證、風寒夾濕證、風熱夾濕證型。279例納入病例當中的64例進行血常規(guī)檢查，分析聚類證型與白細胞總數、中性粒細胞百分比的關系，提示聚類Ⅳ風熱夾濕證組與細菌感染相關；通過根據急性病毒性上呼吸道感染的癥狀學研究，針對性進行血清流感AB，柯薩奇病毒、副流感病毒等抗體檢測。探討血清病毒抗體與聚類證型之間的關系，結果，血清流感病毒AB，柯薩奇病毒以及副流感病毒抗體在聚四類證型之間無相關性。結論1本課題收集的79例急性上呼吸道感染可聚類分為風寒證，風熱證、風寒夾濕證、風熱夾濕證。其中，風熱夾濕證與白細胞總數、中性粒百分比升高相關。2血清流感AB，柯薩奇病毒、副流感病抗體在聚四類證型之間無相關性。

簡介：乙型肝炎病毒HBV基因組全長僅為3200個堿基，包括4個相互重疊的讀框前CC基因、P基因、S基因和X基因。依據核苷酸序列異質性≥8％可將HBV毒株分成不同的基因型。到目前為止一共發(fā)現(xiàn)了8個HBV基因型基因型A、B、C、D、E、F、G和H。E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地帶且與基因型D有類似的基因特征，異質性最為明顯的F型主要分布于南美及中美洲。HBV幾個主要的基因型中均發(fā)現(xiàn)基因亞型現(xiàn)象的存在。其中基因型A可分為A1A33個亞型；基因型B可分為B1B44個亞型；基因型C可分為C1C44個亞型；基因型D分為D1D44個亞型；基因型F可分為F1、F2兩個亞型。結果發(fā)現(xiàn)HBVC1、HBVC2是中國地區(qū)最普遍的HBVC亞型，其中是HBVC1占71％393512，HBVC2占27％112512此外，在對全國血清樣本進行基因分型的過程中，我們任意選取PCRRFLP分型鑒定的基因型B、C、D樣本各3份進行了全序列的測定以判斷該分型方法的準確性。結果發(fā)現(xiàn)，以PCRRFLP分型鑒定為基因型D的部分樣本測序后比較證實為基因型C，后來的研究顯示該種毒株在S區(qū)與基因型D相同，暫時命名為HBVCD重組體。并根據其序列特征建立了該重組體的初步篩選方法。以初步篩選方法對來自甘肅的HBV血清樣本進行了分析，發(fā)現(xiàn)了7例該種重組體；選取其中部分樣本進行HBV全基因序列的測定，測序結果證實重組的存在。這種亞型均為HBV基因型C與基因D毒株的重組體。因此，在中國大陸地區(qū)至少存在3種HBVC基因亞型HBVC1、HBVC2、及HBVCD。如同基因型呈地域性分布的特點一樣，基因型C亞型在我國不同地區(qū)的分布也有很大差異。在北方地區(qū)，98％以上基因型C毒株均屬于C2亞型，C1亞型罕見；而在南方地區(qū)，55％基因型C毒株為C1亞型，C2占較小比例。HBVC1亞型與C2亞型在各省的分布情況為北京2％154與98％5354；山東1％1100與99％99100；云南13％538與87％3338；湖南19％316與81％1316；廣東63％4775與37％2875；海南79％5367與21％1467。在東南地區(qū)的福建省，C1與C2的亞型的比例分別為1％172與99％7172。在中國西部HBV慢性感染人群中，基因型C亞型的情況與其它地區(qū)不同。在甘肅地區(qū)，C亞型的分布比例C1為1％190，C2為91％8290，CD重組體為8％790。本研究中還比較了兩種主要C基因亞型C1與C2感染者之間的臨床差異。人口學資料比較發(fā)現(xiàn)，C1亞型感染者年齡較C2亞型感染者小316±124VS344±120，P003。盡管C1亞型感染者較C2亞型感染者有較高的HBEAG陽性率，兩者之間并無統(tǒng)計學差異。兩組病例在性別比率、肝功能檢查ALT水平及總膽紅素水平及臨床診斷方面未見統(tǒng)計學差異。因此，HBV基因亞型存在的現(xiàn)象對于疾病發(fā)生發(fā)展的影響尚有待進一步研究。在本研究的第二部分，為研究HBV基因型功能學的差異，使用了腺病毒載體將目的HBV基因導入真核細胞，對不同HBV基因型毒株的表達與復制進行了比較研究。腺病毒ADENOVIRUS，AD分布廣泛，在許多哺乳動物和禽類中都發(fā)現(xiàn)其存在。其中人的腺病毒有50種以上，但通常都較溫和，很少危及生命。腺病毒對于研究真核細胞DNA的復制、轉錄，RNA剪接加工，蛋白質的合成以及細胞轉化做出過重要的貢獻。腺病毒還具有高滴度、高穩(wěn)定性、高轉染效率、非致癌性等特點。此外，對野生型腺病毒進行基因工程改造而制作的重組病毒載體系統(tǒng)，作為哺乳動物細胞表達載體、重組疫苗和基因治療載體也得到了廣泛應用。本研究運用了一種新的重組病毒構建方法ADEASYTM系統(tǒng)，在體外模型中研究不同基因型HBV病毒復制活性差異。首先，我們構建了13拷貝HBVB、HBVC全基因組，在其5’末端包含增強子Ⅰ及增強子Ⅱ，復制起點，X及前C啟動子基因，前基因RNA轉錄起始位點，特異多腺苷酸化位點以及完整的X開放讀框。這種結構已被證明能在肝臟細胞及轉基因小鼠中進行有效的復制。隨后，將13拷貝HBV全基因插入到重組病毒穿梭載體PADTRACK的多克隆位點中，該位點位于CMV啟動子及綠色熒光蛋白GFP位點上游，利用該系統(tǒng)，一方面可通過表達的GFP在熒光顯微鏡下觀察重組病毒感染情況，另一方面，構建的13拷貝HBV全基因能夠利用病毒自身的調控序列啟動HBV的復制，避免了載體上的外源啟動子對HBV復制及表達的影響。將重組穿梭質粒與腺病毒骨架載體PADEASY1共轉化ECOLIBJ5183細菌使之內重組。在細菌中發(fā)生同源重組后，選出重組質粒并酶切鑒定，將鑒定出的重組質粒經PACⅠ線性化后使用脂質體介導轉染293細胞，通過GFP可以監(jiān)測轉染效率和病毒的產生。得到重組腺病毒之后，進行純化和擴增，再使用兩種不同基因型HBV重組腺病毒感染HEPG2細胞。使用ELISA法檢測細胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG的表達情況，用美國雅培公司的化學發(fā)光全自動免疫分析儀對細胞及培養(yǎng)上清中的HBSAG及HBEAG進行檢測并進行定量分析；熒光定量法檢測細胞及培養(yǎng)上清中HBV的滴度；免疫組化檢測細胞內HBSAG及HBCAG的表達情況。結果表明，從我國慢性乙肝病毒感染者血清中獲得的HBV基因型B和C毒株，并經過全序列的測定確定其基因型。通過酶切與連接成功構建了兩種基因型的13拷貝HBVDNA，克隆篩選后進行序列測定，證實了兩種基因型13拷貝HBVDNA序列正確無誤。為確保所構建的有復制能力的13拷貝HBVDNA在病毒復制過程中不受這些重要位點的影響，對測序結果進行仔細核對，并與多株參考序列進行比對，排除了有插入、缺失及重要位點突變的克隆。13拷貝HBVDNA序列經雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收后，與腺病毒穿梭載體PADTRACK進行連接，連接物轉化JM109細菌，隨機挑取克隆，雙酶切法初步驗證插入序列片段大小的正確性。重組穿梭載體再用YS1YS2進PCR擴增后，NDEⅠ內切酶消化，驗證插入序列基因型的正確性。兩種基因型的重組穿梭載體分別被命名為ADTRACKHBVB和ADTRACKHBVC；轉化感染受態(tài)細菌ADEASIER1感受態(tài)細胞得到兩種基因型的腺病毒重組體PADEASIERB和PADEASIERC，PACⅠ酶切鑒定其正確性。大量提取的重組腺病毒質粒PADEASIERB和PADEASIERC用PACⅠ酶切線性化后，用脂質體LIPOFECTAMINE2000轉染293細胞轉染710天后，即可在熒光顯微鏡下看見明顯的GFP熒光，隨著培養(yǎng)時間的延長，熒光斑點數也隨之增多，在普通顯微鏡下可見明顯的病毒蝕斑，293細胞也出現(xiàn)固縮、變圓、脫落、裂解等明顯的細胞病變現(xiàn)象，結果證明了重組病毒的形成和擴增。收獲轉染10天后的293細胞及上清液，反復凍融裂解后，再重新感染293細胞。感染2天后細胞即可看到GFP的表達，細胞也出現(xiàn)變圓、脫落、裂解等明顯的細胞病變現(xiàn)象。收獲二次感染的細胞及上清液，反復凍融裂解后，取上清再次感染293細胞，進行病毒的大量擴增，使兩種基因型的重組腺病毒滴度約為109ML。研究表明，兩種重組病毒的包裝是成功的，并且均具有很高的滴度，能夠有效的感染293細胞，并有很強的GFP表達。按感染復數為5的標準，兩種基因型的腺病毒重組體分別感染HEPG2細胞。當感染細胞培養(yǎng)至第5天時收集感染細胞及上清，細胞內HBCAG及HBSAG經免疫組織化學法檢測，均有蛋白表達。細胞及上清中的HBEAG和HBSAG用ELISA法進行檢測，結果可明確檢測到HBEAG及HBSAG的表達；上清及細胞內病毒顆粒經定量檢測后有明確的上升，說明我們所構建的13拷貝HBVDNA能夠在HEPG2細胞內進行表達和復制。分別用兩種不同HBV基因型的重組腺病毒感染HEPG2細胞，以后隔日收集感染細胞及清，并分別對上清中的病毒顆粒、HBEAG及HBSAG進行定性及定量檢測。感染第2天時，上清中即可檢測到病毒顆粒、HBEAG及HBSAG。感染第4天時上清中HBEAG及HBSAG的表達量最高，以后隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，HBEAG及HBSAG的表達量呈下降趨勢，HBEAG及HBSAG的表達量C基因型明顯高于B基因型。上清中病毒顆粒的量在第2天時即達最高值，然后隨培養(yǎng)時間的延長呈緩慢下降趨勢，但兩種基因型間病毒定量無差別。在本研究中，我們證明了腺病毒載體能夠將具有復制能力的HBV基因轉導入肝細胞系，并能啟動HBV復制導致完整的具有感染能力的HBV顆粒的產生，這說明導入的HBVDNA能在被轉染的細胞中復制。腺病毒介導的HBV轉染成功將為我們進一步研究病毒在細胞內的復制能力，比較不同的病毒株復制能力的差異，以及各病毒蛋白在病毒生活周期中的作用提供新的可靠途徑。本研究利用新型腺病毒系統(tǒng)在HBV基因型體外功能學研究方面的進行了初步嘗試。研究結果證明，腺病毒系統(tǒng)能作為HBV體外功能學研究和毒株之間比較研究的非常有效的工具。研究的初步結果顯示，B基因型和C基因型在體外復制過程中其抗原表達有差異，基因型C明顯高于基因型B，但病毒復制水平未見明顯差異。由于本研究只是比較了兩種基因型之間單一毒株的差異，這種初步結果有待進一步更深入的研究加以證實。

簡介：目的采用差異熒光雙向凝膠電泳DIGE技術及質譜技術篩選并鑒定乙型肝炎病毒HBV相關肝纖維化組織差異表達蛋白質，以期獲得肝纖維化早期診斷的分子標志物以及潛在的藥物靶標，并為肝纖維化的病理發(fā)生機制研究提供思路。方法采用DIGE技術篩選CY3、CY5及CY2熒光素標記的肝纖維化及正常肝組織差異表達蛋白質，并用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜MALDITOFMS或串聯(lián)質譜技術進行鑒定并分析，對部分有潛在價值的差異表達蛋白質采用免疫組織化學技術從蛋白質水平進行驗證。結果共篩選出26個差異表達蛋白質點，其中在肝纖維化組織中15個蛋白質點上調，11個蛋白質點下調；上述26個蛋白差異點采用質譜技術成功鑒定出19種蛋白質。根據蛋白質功能的不同，這些差異蛋白質主要參與氧化應激、分子伴侶、細胞骨架、能量代謝及信號傳導等過程；細胞角蛋白8、高遷移組蛋白B1、熱休克蛋白70等在HBV相關肝纖維化組織中高表達；硫氧還蛋白過氧化物酶、三磷酸腺苷合成酶、神經多肽H3等在HBV相關肝纖維化組織中低表達。免疫組化驗證結果表明肝纖維化組織熱休克蛋白70、細胞角蛋白8、高遷移組蛋白B1表達水平均高于正常肝組織，且表達水平隨纖維化程度進展而上調，與蛋白質組分析的結果基本一致。結論蛋白質組學技術是篩選HBV相關肝纖維化組織差異表達蛋白質有效方法。發(fā)現(xiàn)和鑒定出相關的蛋白質，可能成為潛在藥物靶標以及早期診斷、治療的分子標志物，同時也為HBV相關肝纖維化的病理機制研究提供了一個新的研究方法系統(tǒng)。

簡介：手足口病HFOOTMOUTHDISEASEHFMD是由腸道病毒感染引起的一種嚴重的傳染病并呈現(xiàn)逐年高發(fā)態(tài)勢。近年發(fā)現(xiàn)HFMD主要病原體為腸道病毒71型ENTEROVIRUS71EV71兒童為EV71易感人群。兒童感染EV71后臨床表現(xiàn)形式多樣除典型的HFMD外還常表現(xiàn)出嚴重的中樞神經疾病及肺水腫和或肺淤血等并發(fā)癥嚴重的甚至導致死亡。目前對于EV71感染引發(fā)HFMD的發(fā)生發(fā)展過程尚不清楚且缺乏有效的預防及治療方法常導致臨床醫(yī)療嚴重后果的發(fā)生因此明確HFMD病原全面分析EV71感染后病理改變探討發(fā)病機理以及研發(fā)安全、有效的HFMD疫苗成為預防和控制HFMD疾病暴發(fā)的有效手段之一。據此本論文從一例疑似HFMD的死亡案例出發(fā)從法醫(yī)病理學、分子病毒學、動物實驗等幾個方面對該病例及其致病病原EV71進行了深入的研究具體內容有以下五個章節(jié)。第一章以文獻綜述的形式介紹了HFMD及EV71的研究背景主要包括HFMD的流行情況其主要病原體EV71的病毒學特點流行病學研究致病機理研究EV71感染的臨床診斷和治療疫苗的研究現(xiàn)狀實驗動物的選擇以及桿狀病毒表達系統(tǒng)的原理、技術路線及其作為基因工程疫苗載體的研究進展等。最后說明了本論文研究的內容及意義。第二章利用常規(guī)法醫(yī)病理學分析方法對一例疑似HFMD致死案例進行了分析發(fā)現(xiàn)CNS病變明顯神經細胞壞死、膠質小結形成、炎細胞呈袖套樣浸潤肺水腫顯著、炎癥突出確認死因為病毒性腦炎及病毒性肺炎導致的急性呼吸、循環(huán)功能衰竭。在此基礎上利用RTPCR技術以國家CDC指導的EV71通用檢測引物證實病原體為EV71。隨后針對EV71保守區(qū)設計特異性引物進行巢式PCR擴增檢測了各病理組織的病毒載量利用抗EV71VP1蛋白的特異性多克隆抗體對石蠟切片進行免疫組織化學染色檢測了病毒抗原的組織分布。結果顯示此病例腦組織EV71病毒載量相對較高其中腦干和頸髓最高病毒抗原檢測陽性主要集中在CNS的神經細胞及炎細胞為病毒感染復制的主要部位肺組織雖病變明顯水腫淤血突出但病毒核酸及抗原陰性并非病毒主要感染復制部位第三章自病毒載量最高的腦干組織出發(fā)在體外RD細胞上進行病毒的分離、傳代及空斑純化通過一步法生長曲線的方法了解不同株純化病毒的感染性差異同時利用EV71VP1基因的序列對病毒株進行基因分型。篩選出一株純化病毒擴增出核酸序列進行分段克隆獲得EV71病毒的全基因組并提交GENBANK。結果顯示腦干組織能成功分離到EV71XF活病毒在RD細胞上能產生腸道病毒特異性致細胞病變效應CYTOPATHICEFFECTCPE透射電鏡能觀察到大小均勻、形態(tài)一致、直徑約2030NM的EV71病毒粒子。經空斑純化后的四株病毒在體外RD細胞上感染性基本無差別VP1測序結果顯示均為C4亞型完成了一株病毒的全基因組測序基因組全長為7405BPGENBANK登錄號ACCESSIONNUMBER為JQ804832基因組序列提示此次感染病毒仍為國內流行株C4亞型全基因組序列的測定將有利于后續(xù)的深入研究。第四章對純化的EV71XF病毒進行了建立小動物感染模型的初步摸索。通過顱腔注射INTRACRANIALINJECTIONIC的途徑使1日齡BALBC小鼠感染EV71XF病毒觀察其表現(xiàn)隔周采血對血清特異性抗體IGG及中和抗體進行檢測同時分離鼠腦組織中病毒再次接種1日齡小鼠獲得鼠適性毒株。結果發(fā)現(xiàn)1日齡BALBC小鼠能通過IC途徑感染EV71XF但無明顯的神經系統(tǒng)受累表現(xiàn)血清抗體IGG在感染兩周后較高但仍處于亞中和抗體水平IC二次感染可以刺激小鼠產生更高濃度IGG并在RD細胞上表現(xiàn)出較好的特異性及交叉性中和保護作用母傳抗體的中和保護作用較強但時間短暫約4W齡時其保護作用消失反復多次鼠腦適應可以得到感染性增強的鼠適株EV71XFAJQ但其毒力情況還需進一步研究。第五章利用桿狀病毒表達系統(tǒng)開展了EV71基因工程疫苗的初步研究。將編碼EV71XF的P1和3CD蛋白的基因分別克隆至PFASTBACDUAL載體的啟動子PPH和PP10下游的多克隆位點構建重組PFASTBACDUALEV71XF3CDP1質粒。重組質粒與桿狀病毒BAC轉座后獲得重組BACBACEV71XF3CDP1。提取重組BACDNA轉染昆蟲SF9細胞獲得重組病毒重組病毒感染昆蟲細胞后表達的前體蛋白P1在蛋白水解酶3CD的剪切后自組裝為病毒樣顆粒VIRUSLIKEPARTICLEVLPS經蔗糖及氯化銫密度梯度離心進行初步的純化WESTERNBLOT檢測目的蛋白表達與剪切透射電鏡觀察VLPS顆粒另外還構建了新的穩(wěn)定表達3CD的細胞系SF93CD用于VLPS的構建策略。結果顯示重組桿狀病毒ACBACEV71XF3CDP1在SF9細胞內能同時表達前體蛋白P1和蛋白水解酶3CD3CD能正確剪切P1蛋白成為VP1等結構蛋白并自組裝為VLPS經蔗糖及氯化銫密度梯度離心等初步純化后WESTERNBLOT顯示VLPS具有VP1的抗原表位透射電鏡觀察VLPS的形態(tài)、大小及構象均類似于天然的EV71病毒粒子可以作為EV71疫苗的候選物。SF93CD細胞系能穩(wěn)定表達3CD蛋白并剪切P1形成VLPS可以作為構建VLPS的新途徑。綜合以上研究內容本研究完成了一例疑似HFMD案例的法醫(yī)病理學分析確定了其致病病原為腸道病毒EV71并從病理組織中分離、純化到一株高活性的EV71XF病毒完成了該病毒株的病毒感染活性檢測、全基因組序列測定、小鼠感染性試驗以及基因工程疫苗等初步研究。該研究為致死性EV71病毒感染的組織病變過程的解析和機理研究提供了重要的實驗數據也為EV71病毒的基因工程疫苗研究奠定了基礎對預防和控制HFMD的工作作出了重要貢獻。

簡介：點擊查看更多細小病毒B19結構蛋白VP1獨特區(qū)和VP1-VP2共同區(qū)主要抗原片段的原核表達、純化及血清學應用研究.pdf精彩內容。