簡介：風(fēng)疹病毒RUBELLAVIRES，RV是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，人類是RV的唯一自然宿主。人群對RV普遍易感，感染后可發(fā)生風(fēng)疹。RV除了感染人外，實驗室還能感染恒河猴、絨猴、猩猩、狒狒、乳鼠、地鼠和兔等野生和實驗動物，并出現(xiàn)與人相似的感染過程，包括潛伏期、病毒血癥及免疫應(yīng)答反應(yīng)等，但不出疹，僅狒狒感染RV后出現(xiàn)皮疹。風(fēng)疹RUBELLA，也叫德國麻疹，通常是一種非常溫和的疾病，一般不引起嚴(yán)重后果，通常只引起皮疹、頜下淋巴結(jié)腫大和其他輕微的體征。但在年長的兒童和成年人，尤其是婦女，風(fēng)疹的后果可能要嚴(yán)重的多，包括關(guān)節(jié)疾病和紫癜。RV感染的危害主要在于先天性感染，即胎兒宮內(nèi)感染。孕期前12周感染可導(dǎo)致胎兒先天風(fēng)疹感染和80～90％的患風(fēng)疹的孕婦流產(chǎn)。胎兒的先天性感染會導(dǎo)致先天性風(fēng)疹綜合征，累及多器官、多系統(tǒng)，并存在長期的活性感染。臨床上，病毒存在于病人的鼻咽分泌物、血液、糞便和尿液中。雖然風(fēng)疹經(jīng)常為隱性感染，但亞臨床表現(xiàn)的病人也有傳染性，這對風(fēng)疹的預(yù)防帶來了一定的難度。病毒通過氣溶膠擴(kuò)散，在出現(xiàn)皮疹前的7天和出現(xiàn)皮疹后的7天從鼻咽排出，具有傳染性。先天性風(fēng)疹綜合征包括結(jié)構(gòu)畸形主要表現(xiàn)為神經(jīng)性耳聾，白內(nèi)障，心臟疾病如肺動脈和心臟瓣膜狹窄、動脈導(dǎo)管未閉和智力發(fā)育障礙，晚期并發(fā)癥包括糖尿病、甲狀腺疾病、生長激素缺乏和進(jìn)行性腦炎。1962年，風(fēng)疹的病原體RV分離成功，為RV的分子生物學(xué)研究、血清學(xué)檢測、RV感染特別是先天性感染的診斷及疫苗研制等奠定了基礎(chǔ)。RV基因組為單股正鏈40SRNA，全長9762個核苷酸，其5CE2E1COOH。C蛋白富含脯氨酸和精氨酸，與病毒RNA結(jié)合構(gòu)成核衣殼，在病毒從一個宿主細(xì)胞感染另一個宿主細(xì)胞的過程中對病毒基因組起保護(hù)作用。包膜糖蛋白E1和E2以異二聚體的形式存在于病毒包膜表面，形成刺突，含有能刺激宿主產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答的抗原表位。E1糖蛋白具有血凝素活性，還能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，是RV的主要抗原。應(yīng)用單克隆抗體MAB研究發(fā)現(xiàn)，E1至少有6種不重復(fù)的抗原位點，主要位于E1的246～285位氨基酸。雖然E1的整個氨基酸序列在不同的毒株之間存在一定差異，但是在抗原決定簇集中的區(qū)域，其氨基酸順序卻是一致的。因此E1是RV免疫原性、分子流行病學(xué)、遺傳與變異和疫苗研制研究的重要目的蛋白。E1糖蛋白共有481個氨基酸，有三個N聯(lián)糖化位點，分別位于天冬酰胺N76、177、和209，在E1中這三個糖基化位點都被糖基化，每個位點連接的糖鏈約為2KD，糖基化對于保持E1的生物學(xué)活性非常重要，而且會影響E1轉(zhuǎn)運到高爾基體，對維持E1的正確折疊和構(gòu)型有重要作用。E2蛋白由282個氨基酸組成，分子量為42～47KD，有3～4個N聯(lián)糖基化位點。E2C端保留了EL蛋白的信號肽，富含半胱氨酸殘基14個，通過鏈內(nèi)和鏈間的二硫鍵與E1蛋白形成穩(wěn)定的E1E2異二聚體，利用E2蛋白上的靶信號將異二聚體轉(zhuǎn)運至高爾基體，進(jìn)一步組裝成病毒顆粒。E2蛋白的生物學(xué)作用尚未確定，E2可能含有特異性的表位并且至少含有一個中和表位，也能刺激機體產(chǎn)生中和抗體，但抗原性弱。在E1E2復(fù)合物中，E2表位可能被E1遮蓋，而不易接近宿主免疫系統(tǒng)，因而在RV感染中誘導(dǎo)低水平的免疫反應(yīng)。另外，E2在自身免疫性疾病中有一定作用，其生物學(xué)重要性同樣不能忽視。因為很多病毒感染產(chǎn)生的癥狀與風(fēng)疹的癥狀很相似，所以臨床診斷風(fēng)疹不可靠?？煽康脑\斷依賴于特定的實驗室檢查。RV感染的實驗室診斷方法主要包括病毒分離、病毒顆粒的電子顯微鏡觀察、血清學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)、病毒基因的診斷等。病毒分離是一種經(jīng)典的、非?？煽康脑\斷方法，但培養(yǎng)周期長，操作復(fù)雜，生物影響因素多，因此一般不用作常規(guī)診斷方法。目前RV感染的診斷主要以血清學(xué)診斷為主，目前常用的實驗包括酶聯(lián)免疫吸附實驗ELISA、血凝抑制實驗HI、放射免疫技術(shù)RIA、乳膠凝集試驗LA、被動血凝試驗PHA和免疫熒光試驗IFA等幾種方法。其中ELISA為目前的首選方法。我國生產(chǎn)的用于檢測RV抗體的ELISA試劑盒為細(xì)胞培養(yǎng)抗原，其不足之處在于抗原純化時難以完全排除其中的細(xì)胞蛋白成分，抗原成分不均一，性質(zhì)不夠穩(wěn)定，靈敏度及特異度較差。而國外進(jìn)口的試劑盒雖然質(zhì)量較高，但價格普遍昂貴，不適合基層實驗室的使用。因此，構(gòu)建RV抗原的重組表達(dá)克隆，研究制備我國自己的重組RV抗原具有重要實際意義。聚合酶鏈反應(yīng)PCR技術(shù)出現(xiàn)以后，逐步發(fā)展了直接檢測RV核酸的診斷方法。用PCR檢測RVRNA，方便、快捷、靈敏度高、結(jié)果可靠，是很有前途的實驗診斷方法。但該檢測方法要求一定的設(shè)備和技術(shù)條件，不易在基層實驗室推廣使用，而且容易造成實驗室污染，產(chǎn)生假陽性。自病毒分離成功后，各國致力于風(fēng)疹疫苗的研究。1966年MEYER首先研制成功HPV77株風(fēng)疹減毒活疫苗，1969年獲準(zhǔn)在美國使用。其它一些毒株的風(fēng)疹減毒活疫苗也相繼問世。目前國外使用的風(fēng)疹減毒活疫苗主要有以下幾種HPV77DE5或HPV77DK12疫苗，CEHILL疫苗，RA273疫苗，TO336疫苗。HPV77DE疫苗免疫效果肯定，但副反應(yīng)發(fā)生率高；CEHILL疫苗免疫效果好，副反應(yīng)也相對較低，但由于成本高，、目前世界上很少使用；TO336疫苗也有較高的免疫原性，安全性較好，其產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答類似于自然感染，并可能形成鞏固的免疫；RA273疫苗接種后可產(chǎn)生沉淀抗體和口咽部局部分泌性IGASIGA，同時接種后的反應(yīng)也較HPV77疫苗輕，因此是目前應(yīng)用范圍最廣的風(fēng)疹減毒活疫苗。該活疫苗于1979年在美國通過審批并投入使用，該疫苗抗體陽轉(zhuǎn)率在95％以上，接種后可能有短期發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大及關(guān)節(jié)腫痛等反應(yīng)，免疫后抗體持久性一般可維持10年左右。因為減毒活疫苗的RNA有感染性，有回復(fù)突變的可能，而且疫苗可通過胎盤，導(dǎo)致胎兒感染，有潛在的致畸可能性。所以，其安全性仍存在著較大爭議。而且成年婦女接種后可發(fā)生一過性關(guān)節(jié)炎10％和關(guān)節(jié)痛25％，尤其是產(chǎn)后接種。因此有必要開發(fā)新型疫苗。RV基因工程疫苗則能消除減毒活疫苗的上述缺點，是當(dāng)今RV研究的熱點之一。本研究采用現(xiàn)代分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，如基因重組、基因克隆、序列分析、基因的真核表達(dá)、SDSPAGE、WESTEMBLOT、ELISA等，構(gòu)建了RV包膜糖蛋白EL的全長基因的酵母表達(dá)載體，并在畢赤酵母中表達(dá)出E1糖蛋白，經(jīng)SDSPAGE和WESTERNBLOT分析后，將重組蛋白包被ELISA檢測板，用于檢測90份人類血清，并與進(jìn)口和國產(chǎn)試劑盒做了比較分析。將所得的重組抗原免疫BABLC鼠，觀察其免疫原性。一、風(fēng)疹病毒包膜糖蛋白EL酵母表達(dá)載體的構(gòu)建以質(zhì)粒PMDL8TEL為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增RV糖蛋白EL的全長基因，并在基因兩端創(chuàng)建相應(yīng)的酶切位點。EL基因與PBLUⅡSK載體均經(jīng)雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)氨芐青霉素和藍(lán)白斑篩選并測序，建立了克隆載體PBLUⅡSKEL，克隆載體與表達(dá)載體PGAPAAA雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)ZEOCIN篩選并測序。結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)一條約15KB的條帶，體外重組技術(shù)重組于重組質(zhì)粒PBLUⅡSK和PGAPAAA后，經(jīng)PCR、ECⅠ及XBAⅠ雙酶切均出現(xiàn)相應(yīng)長度的片段，測序證實為包膜糖蛋白EL的基因。本研究首先成功地構(gòu)建了含有RV包膜糖蛋白EL全基因的克隆載體及酵母表達(dá)載體，為EL糖蛋白的表達(dá)和生物學(xué)特性的研究奠定了基礎(chǔ)。二、風(fēng)疹病毒JR23株糖蛋白EL在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和抗原性分析EL基因的表達(dá)質(zhì)粒PGAPZΑAE1經(jīng)AVRⅡ線性化后用LICL法轉(zhuǎn)化酵母菌，在YPD含100ΜGMLZEOCIN平板上兩次篩選，挑出單菌落，于液體YPD中培養(yǎng)，并在不同時點收集培養(yǎng)物，用SDSPAGE和WESTEMBLOT進(jìn)行分析。SDSPAGE分析顯示EL重組蛋白在畢赤酵母中高效穩(wěn)定表達(dá)，在48H時表達(dá)量達(dá)到最高，之后趨于穩(wěn)定，上清和細(xì)胞中均有蛋白表達(dá)。WESTERNBLOT分析結(jié)果表明上清中的EL重組蛋白能夠分別與抗RV的陽性血清和單克隆抗體MAB反應(yīng)，而細(xì)胞中的EL重組蛋白只能與抗RV的陽性血清反應(yīng)，不能與MAB反應(yīng)。這說明所表達(dá)的蛋白一部分在信號肽的引導(dǎo)下分泌出細(xì)胞外，并經(jīng)過折疊形成了正確的構(gòu)象，能夠與MAB結(jié)合；而另一部分由于蛋白本身的跨膜區(qū)連在了細(xì)胞膜上沒有分泌出去，沒有形成能夠被MAB識別的構(gòu)象，不能與MAB結(jié)合。提示E1包膜糖蛋白在酵母菌中成功表達(dá)，且免疫反應(yīng)性良好。三、酵母系統(tǒng)表達(dá)的風(fēng)疹病毒E1糖蛋白在ELISA診斷中的應(yīng)用研究將重組E1抗原和RV分別作為包被抗原，用間接ELISA法檢測90份臨床血清標(biāo)本，同時用晶美JINGMEI進(jìn)口分裝試劑盒和德國RECI公司試劑盒進(jìn)行檢測；將RECI試劑盒作為金標(biāo)準(zhǔn)，計算另外三者檢測結(jié)果的特異度、靈敏度和符合率；比較它們之間的差別有無統(tǒng)計學(xué)意義，特別是重組抗原與病毒抗原作為包被抗原檢出RV抗體陽性率的差別有無統(tǒng)計學(xué)意義。與德國試劑盒相比，該重組抗原靈敏度為6711％，特異度為7143％，兩者的符合率為6778％；病毒抗原分別為50％、7857％、5444％；晶美試劑盒分別為8471％、7143％、8222％。重組蛋白重復(fù)性實驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理P005，差別無統(tǒng)計學(xué)意義；RECI試劑盒與重組抗原、病毒抗原的檢測結(jié)果的差別有統(tǒng)計學(xué)意義P005；晶美試劑盒與重組抗原的檢測結(jié)果的差別有統(tǒng)計學(xué)意義PTCID的RVJR23、溶于100ΜLPBS的PGAPZΑA空質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物免疫實驗動物的不同組。初次免疫后的第2、4、6周，均用初次免疫減半的抗原量再次免疫。末次免疫后，鼠眶靜脈取血，凝固后取血清，ELISA法檢測血清中的抗風(fēng)疹I(lǐng)GG抗體。用卡方檢驗對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，X217885，P005，可見各組之間檢測結(jié)果的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。分別比較實驗組與其他4個組之間的檢測結(jié)果。實驗組與空白對照組檢測結(jié)果的差別有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認(rèn)為實驗組的陽性率高于空白對照組的陽性率。實驗組與陽性對照組1的檢測結(jié)果的差別無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組與陽性對照組2的檢測結(jié)果的差別無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組與陰性對照組的檢測結(jié)果的差別有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認(rèn)為實驗組的陽性率高于陰性對照組的陽性率。此檢驗結(jié)果表明，在本研究中，重組抗原作為免疫原免疫BABLC小鼠與減毒活疫苗作為免疫原免疫BABLC小鼠、RVJR23株作為免疫原免疫BABLC小鼠的免疫效果的差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與PBS和空載體的表達(dá)產(chǎn)物的免疫效果的差別有統(tǒng)計學(xué)意義，證明重組抗原能使小鼠產(chǎn)生風(fēng)疹的特異性抗體，是一種較好的免疫原。將眶靜脈取血后的小鼠拉頸處死，無菌取脾，制成單個細(xì)胞懸液，進(jìn)行脾的淋巴細(xì)胞增殖實驗MTT法。對檢測結(jié)果進(jìn)行隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析，F(xiàn)730，P005，表明5組之間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義。隨后選擇陰性對照組的結(jié)果為對照，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較的新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果實驗組和陰性對照組間的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的差別有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認(rèn)為實驗組的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性高于陰性對照組的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性，陽性對照組1和陽性對照組2的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性與陰性對照組間的淋巴細(xì)胞反應(yīng)性的差別均無統(tǒng)計學(xué)意義。從本實驗結(jié)果可得出結(jié)論成功地構(gòu)建了RV包膜糖蛋白E1的酵母表達(dá)載體，并在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功地表達(dá)出了E1蛋白，且免疫反應(yīng)性良好，該重組蛋白可以作為ELISA實驗包被抗原的來源，且優(yōu)于RV作為包被抗原，該重組抗原能使小鼠產(chǎn)生風(fēng)疹的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，是一種較好的免疫原。本實驗為RVE1包膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究，新型疫苗的開發(fā)和應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。

簡介：本實驗研究了丙型肝炎病毒HCV持續(xù)感染對體外培養(yǎng)人合體滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響及其機理。主要內(nèi)容如下一、HCV持續(xù)感染對體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。人晚期囊胚著床后，滋養(yǎng)層內(nèi)層分裂生長的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞迅速分化為合體滋養(yǎng)層細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞對受精卵的著床以及母體胎兒交互式血液循環(huán)的建立均有重要意義，其可侵入母體子宮蛻膜及子宮螺旋動脈，是胎盤形成的主要功能細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞是人體正常細(xì)胞中唯一具有侵襲能力的細(xì)胞，類似于腫瘤細(xì)胞。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞也具有活躍的合成物質(zhì)的能力，其合成分泌的人絨毛膜促性腺激素HCG、人胎盤生乳素HPL等對妊娠的維持以及胎兒的發(fā)育均有十分重要的意義。因此，本實驗分別采用MATRIGEL人工重建基底膜侵襲實驗來研究HCV感染對體外培養(yǎng)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力的影響，并研究細(xì)胞感染HCV后粘附、移動能力以及激素合成分泌能力以HCG為檢測因子的改變。研究證實HCV持續(xù)感染可抑制體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞包括侵襲能力和激素合成分泌能力在內(nèi)的多種生物學(xué)功能。二、HCV持續(xù)感染對體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP2和MMP9合成分泌的影響。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力是其侵入母體子宮蛻膜及子宮螺旋動脈，參與形成胎盤胎盤屏障的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究表明，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力與金屬蛋白酶2MATRIXMETALLOPROTEINASE2，MMP2和金屬蛋白酶9MATRIXMETALLOPROTEINASE9，MMP9密切相關(guān)，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞合成分泌MMP2和MMP9，降解細(xì)胞外基質(zhì)ECM，穿越ECM間隙，從而完成侵襲過程。在前一部分實驗的基礎(chǔ)上，本部分實驗通過ELISA、明膠酶譜分析以及RTPCR等方法研究HCV持續(xù)感染對合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP2和MMP9合成分泌的影響，探討HCV感染抑制合體滋養(yǎng)層細(xì)咆侵襲能力的具體分子機制。研究結(jié)果表明HCV持續(xù)感染時體外培養(yǎng)人胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MMP2和MMP9合成與侵襲、粘附、運動能力相關(guān)分泌能力下降，為非特異性。因而我們推測細(xì)胞激素合成分泌能力下降所致細(xì)胞分化成熟障礙是細(xì)胞侵襲能力以及侵襲相關(guān)的粘附、運動能力的下降的主要原因。

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簡介：遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文遵義市及周邊地區(qū)BNA病病毒感染分子流行病學(xué)研究姓名王長明申請學(xué)位級別碩士專業(yè)神經(jīng)病學(xué)指導(dǎo)教師徐平20090501遵義醫(yī)學(xué)院碩十學(xué)位論文遵義市及周邊地區(qū)BORNA病毒感染分子流行病學(xué)研究STUDYONMOLECULAREPIDEMIOLOGYOFBORNADISEASEVIRUSINZUNYIREGIONSANDITSSURROUNDINGREGIONSABSTRAETBJECTIVEINORDERTOSTUDYTHEEPIDEMICSOFBORNADISEASEVIRUSBIVINZUNYIREGIONANDITSSURROUNDINGREGIONSINGUIZHOUPROVINCEMETHODSP24FRAGMENTOFBIVFRAGMENTSINPERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELLSPBMCFROM43PATIENTSWITHVIRALENCEPHALITISVE，9CASESWITHMULTIPLESCLEROSISMS，7CASESWITHGUILLAINBARRESYNDROMEGBS，5CASESWITHPARKINSONDISEASEPD，98HEALTHYDONORSAND300GOATSWEREEXAMINEDBYQUANTITATIVEFLUORESCENCENESTEDREVERSETRANSCRIPTASEPOLYMERASECHAINREACTIONPCRGENESEQUENCEANDAMINOACIDSEQUENCEWEREANALYZEDFORPOSITIVEPRODUCTSRESULTS7LHEPOSITIVERATEOFBIVP24FRAGMENTINPBMCFROMVE1395％ANDMS2222％WERESIGNIFICANTLYHIGHERTHANINHEALTHYDONORS0％，PO05％，GUILLAINBARRESYNDROMEANDPARKINSONDISEASEPDWERETESTEDNEGATIVETHESEQUENCEOFTHEBDVP24FRAGMENTFROMTHEPATIENTSWITHVLIWASINCONFORMITYWITHTHATOFTHEMS，RESULTSPRESENTEDTHAT3SITUSCONSISTENCYSILENTMUTATIONWHENCOMPAREDWITHSTAINVANDITSHOMOGENEITYWAS9651％，2SITUSCONSISTENCYSILENTMUTATIONCOMPAREDWITH7

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簡介：肥胖癥作為一種營養(yǎng)代謝性疾病，是心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、高脂血癥以及癌癥等多種疾病的高危因素，現(xiàn)已成為全球性的健康問題。多年來研究發(fā)現(xiàn)肥胖的發(fā)生與下丘腦對攝食的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控密切相關(guān)，由下丘腦分泌的促食肽黑色素濃集激素（MCH）及其受體（MCHR1和MCHR2）的發(fā)現(xiàn)為肥胖發(fā)生機制及防治的研究提供了新的靶點。通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物模型已對MCH及MCHR1與肥胖及能量代謝的關(guān)系進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，但有關(guān)MCHR2的功能及其與肥胖的關(guān)系至今仍不清楚。因此，本課題一方面構(gòu)建了靶向人MCHR2基因的SIRNA重組腺病毒載體，以便從動物水平研究MCHR2的功能；另一方面構(gòu)建了兩個穩(wěn)定表達(dá)MCHR2基因的細(xì)胞株SHSY5YMCHR2及SHG44MCHR2，并利用這兩個細(xì)胞株進(jìn)行MCHR2功能的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，從細(xì)胞蛋白整體水平探討MCHR2功能及作用機制。研究內(nèi)容包括以下三個部分1人MCHR2基因SIRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定。方法人工合成靶向MCHR2的SIRNA干擾序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭載體PSESHUS上得到PSESHUSMCHR2SIRNA，并與腺病毒骨架質(zhì)粒PADEASY1在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組得到PADEASYSESHUSMCHR2SIRNA，在HEK293細(xì)胞中包裝成重組腺病毒，感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCHR2的CHO細(xì)胞株CHOMCHR2，RTPCR及WESTERNBLOT檢測腺病毒對細(xì)胞MCHR2表達(dá)的影響。結(jié)果PSESHUSMCHR2SIRNA經(jīng)KPNⅠ、ECⅤ雙酶切后只有8500BP左右的條帶，同時測序結(jié)果正確，證明構(gòu)建成功。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PACⅠ酶切后可見一條45KB和一條約30KB的條帶，表明同源重組成功。線性化同源重組的腺病毒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，于熒光顯微鏡下可見紅色熒光表達(dá)。ADEASYMCHR2SIRNA（50PFUCELL）處理CHOMCHR2細(xì)胞48H后，RTPCR及WESTERNBLOT檢測到MCHR2在轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的表達(dá)都明顯降低（相比ADEASYSESHUS對照組）。結(jié)論成功構(gòu)建MCHR2SIRNA重組腺病毒載體，ADEASYMCHR2SIRNA腺病毒能有效地抑制CHOMCHR2細(xì)胞中MCHR2表達(dá)，能夠用于動物水平研究MCHR2功能。2穩(wěn)定表達(dá)人MCHR2基因的SHG44MCHR2及SHSY5YMCHR2細(xì)胞株的建立與鑒定。方法①PCR法從人胎腦CDNA文庫擴(kuò)增MCHR2全長CDNA片段。用基因重組方法將其克隆到PCDNA31（），構(gòu)建真核表達(dá)載體PCDNA31（）MCHR2，并用LIPOFECTAMIM轉(zhuǎn)染到SHG44細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)MCHR2的SHG44細(xì)胞系，命名為SHG44MCHR2，用RTPCR、WESTERNBLOT及免疫熒光法檢測MCHR2的表達(dá)，并檢測細(xì)胞內(nèi)CA2流動。②用基因重組方法將MCHR2全長CDNA克隆到質(zhì)粒PEGFPN1，構(gòu)建真核表達(dá)載體PEGFPN1MCHR2，并用LIPOFECTAMIM轉(zhuǎn)染到SHSY5Y細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)MCHR2的SHSY5YMCHR2細(xì)胞系命名為SHSY5YMCHR2，采用RTPCR、WESTERNBLOT檢測MCHR2的表達(dá)并用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果①擴(kuò)增出MCHR2全長CDNA；成功構(gòu)建PCDNA31MCHR2；RTPCR、WESTERNBLOT及免疫熒光法檢測SHG44MCHR2到MCHR2的表達(dá)，并準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜上。MCH作用于MCHR2后，可促使細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放CA2進(jìn)而使胞內(nèi)CA2濃度出現(xiàn)明顯而短暫的升高，CA2振蕩過程在MCH刺激后30～50S內(nèi)完成。②成功構(gòu)建真核表達(dá)載體PEGFPN1MCHR2；RTPCR、WESTERNBLOT檢測到SHSY5YMCHR2細(xì)胞MCHR2的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染PEGFPN1MCHR2的SHSY5YMCHR2細(xì)胞融合蛋白定位于細(xì)胞膜，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PEGFPN1的SHSY5Y細(xì)胞（命名為SHSY5YMOCK）EGFP定位于全細(xì)胞。結(jié)論成功建立了穩(wěn)定表達(dá)MCHR2基因的SHG44MCHR2及SHSY5YMCHR2細(xì)胞株，為后續(xù)關(guān)于MCHR2功能的體外蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下了基礎(chǔ)。3人MCHR2基因功能的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。方法通過雙向凝膠電泳分離MCH處理后的SHG44MCHR2細(xì)胞與其對照細(xì)胞SHG44MOCK、SHSY5YMCHR2細(xì)胞與其對照細(xì)胞SHSY5YMOCK細(xì)胞總蛋白，并對2DE條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選取了SHSY5YMCHR2細(xì)胞與其對照細(xì)胞SHSY5YMOCK細(xì)胞PH310NL膠條（上樣量200ΜG）的電泳圖進(jìn)行PDQUEST圖像分析，MALDITOF質(zhì)譜鑒定，MOT軟件查詢SWISSPT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；半定量RTPCR檢測INSIG2、ACOT8、IDH3A、PCK1、PFKFB4MRNA水平變化，WESTERNBLOT在蛋白質(zhì)水平對IDH3A及PFKFB4進(jìn)行驗證。結(jié)果MCH處理后的SHSY5YMCHR2細(xì)胞與其對照細(xì)胞SHSY5YMOCK細(xì)胞用PH310NL膠條（上樣量200ΜG）獲得分辨率高、重復(fù)性好的細(xì)胞雙向電泳圖譜，圖像分析顯示有43個蛋白斑點表達(dá)有差異，經(jīng)MALDITOF檢測，鑒定了34個可能蛋白，21個上調(diào)表達(dá)（IDH3A、PCK1、PFKFB4、ACSM5等），13個下調(diào)表達(dá)（INSIG2、ACOT8、RAB2B等）。MCH處理后的SHSY5YMCHR2細(xì)胞IDH3A、PCK1、PFKFB4MRNA表達(dá)上調(diào)，而INSIG2、ACOT8MRNA表達(dá)下調(diào)。IDH3A、PFKFB4蛋白質(zhì)在MCH處理的SHSY5YMCHR2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。結(jié)論MCH處理后的SHSY5YMCHR2細(xì)胞與其對照細(xì)胞SHSY5YMOCK細(xì)胞有多種蛋白質(zhì)差異表達(dá)，這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞的脂代謝、糖代謝、能量代謝及細(xì)胞轉(zhuǎn)運等多種信號通路，提示MCHR2可能通過這些蛋白質(zhì)參與了能量平衡的調(diào)節(jié)，并可能與肥胖、糖尿病等疾病相關(guān)聯(lián)。

簡介：目的1探討河北省病毒性腦炎病原構(gòu)成情況和流行特點為我省病毒性腦炎的監(jiān)測和預(yù)防控制提供科學(xué)依據(jù)。2了解蓋塔病毒在河北省地區(qū)人群中的感染情況。方法1標(biāo)本的收集和運輸根據(jù)病毒性腦炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)對患者進(jìn)行急性期血清和腦脊液的采集。標(biāo)本主要來自病毒性腦炎監(jiān)測點醫(yī)院和部分非監(jiān)測點醫(yī)院等。所有標(biāo)本均在帶冰條件下運送至實驗室檢測并置于70℃冰箱中保存。2標(biāo)本的檢測用酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA的方法對所有標(biāo)本檢測乙型腦炎病毒JEVIGM抗體然后對JEVIGM抗體陰性的部分血清標(biāo)本檢測7種病毒IGM抗體包括腸道病毒EVS、單純皰疹病毒HSV、風(fēng)疹病毒RV、腮腺炎病毒MUV、水痘帶狀皰疹病毒VZV、EB病毒EBV和巨細(xì)胞病毒CMV。此外用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RTPCR的方法對100例病毒性腦炎病人的血清或腦脊液標(biāo)本檢測蓋塔病毒GETAHVIRUSGETV的基因。3資料的收集對近十年來河北省上報的乙型腦炎資料進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理參考我省已發(fā)表的有關(guān)此課題的文獻(xiàn)分析其流行特征。結(jié)果1從各個監(jiān)測點醫(yī)院共收集到384例病毒性腦炎病人的431份標(biāo)本其中血清220份腦脊液211份。大部分病例來自河北省中南部地區(qū)的石家莊669％邢臺117％和保定107％。病例年齡分布在29天到79歲之間其中2對所有標(biāo)本進(jìn)行了乙腦病毒IGM抗體的檢測檢測出陽性病例28例陽性率為73％28384。由于所用試劑盒不能用于檢測腦脊液標(biāo)本故從乙腦IGM抗體陰性的356例病例中選取了189例病例的193份血清標(biāo)本進(jìn)行了上述七種病毒的特異性IGM抗體的檢測。189例病例中病毒特異性IGM抗體陽性者104例陽性率為55O％未知病原者85例450％。陽性病例的病原中EVS43例陽性率228％占首位其次為HSV23例122％、MUV18例95％、VZV12例63％、EBV5例26％、CMV2例11％、RV1例05％。對所有IGM抗體陽性病例按地區(qū)分布進(jìn)行統(tǒng)計顯示石家莊地區(qū)病毒性腦炎病例中EVS占有很大比例其次為HSV。而邯鄲地區(qū)病毒性腦炎病例中MIJ、廠占有較大比例。3經(jīng)分子生物學(xué)檢測在100例病毒性腦炎病例的標(biāo)本中50份腦脊液標(biāo)本和50份血清標(biāo)本未檢測到GETV基因陽性的標(biāo)本。4河北省自疫苗大規(guī)模使用以來流行性乙型腦炎發(fā)病率大幅度下降2000年以后發(fā)病率降低到0110萬以下成為全國的低發(fā)省份之一近十年來乙腦疫情整體呈逐年下降趨勢。發(fā)病具有明顯的季節(jié)性80％以上的病例集中在7至10月份但其它月份均有散發(fā)病例。全省11個市都有病例發(fā)生但發(fā)病較集中于河北省中南部的邯鄲、滄州、邢臺、衡水等地而位處西北部的張家口、承德發(fā)病則較少。病例主要為學(xué)生、農(nóng)民和散居兒童572％的病例為15歲以下兒童男女比例為151。結(jié)論1病毒性腦炎好發(fā)于15歲以下的兒童和青少年男性多于女性發(fā)病高峰在夏秋季EVS、HSV和MUV是河北省病毒性腦炎的主要病原。今后應(yīng)加強腸道病毒性腦炎、單純皰疹病毒性腦炎和腮腺炎病毒性腦炎等的監(jiān)測和防治。2雖然從河北省蚊蟲標(biāo)本中成功分離出蓋塔病毒但尚不能確定蓋塔病毒的人群感染情況。3河北省乙型腦炎的發(fā)病率自2000年以后降到0110萬以下成為全國的低發(fā)省份之一。近十年來疫情整體呈逐年下降趨勢。JEV已不再是病毒性腦炎的首要病原。4河北省不同地區(qū)病毒性腦炎的病原分布特征不同應(yīng)結(jié)合當(dāng)?shù)厍闆r針對性開展病毒性腦炎的監(jiān)測和預(yù)防控制。

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簡介：血清炎癥及乙型肝炎病毒學(xué)指標(biāo)對虧判斷原發(fā)性肝癌患者手術(shù)預(yù)后的價值THEVALUENFSERUMINFLAMMATORYANDHEPATITISBVIRUSRELATEDMARKERSINPROGNOSISOFHEPATOCEILULARCARCINOMAAFTERRESECTION研究生姓名指導(dǎo)教師導(dǎo)師組成員學(xué)科專業(yè)培養(yǎng)單位王劍邱雙健教授孫健副教授外科學(xué)肝外科復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院塑絲塹絲蘭型旦壟塹墨蘭翌堡翌王型墮堡莖竺墅堡墨量查堡巫塑墮曼塑墮型壅縮略詞表●AFPAIPHAFETOPROTEIN甲胎蛋白ALBALBUMIN白蛋白ALTALANINEAMINOTRANSFERASE丙鲺酸氧基轉(zhuǎn)移酶BCLCBARCELONACLINIEALLIVERCANCER巴塞羅那臨床肝癌分期GGTHBEAGIL．1OSPDOFPTTROCTACETBTGF一0L1HF一ⅡTTRGAMMAGLUTAMYLTRALLSPCPTIDASEHEPATITISBEANTIGENIMERLEUKIN10VERALLSURVIVALPLATELETDERIVEDGROWTHFACTORPROTHROMBINTIMERECEIVEROPERATORCHARACTERISTICCURVETRANSCATHETERARTERIAICHEMOEMBOLIZATIONTOTALBILIRUBINTRANSFORMINGFOWTHFACTORB1TUMORNECROSISFACTOR．DTIMETORECURRENCE0一谷氨?；D(zhuǎn)肽酶乙肝病毒E抗原白介素，1總生存血小板源性生長因子凝血酶原時間受試者工作特征曲線經(jīng)導(dǎo)管肝動脈栓塞化療術(shù)總膽紅素轉(zhuǎn)化生長因子BL腫瘤壞死因子_旺復(fù)發(fā)間隔期

簡介：點擊查看更多食管癌的人乳頭瘤病毒的病因?qū)W及其環(huán)境危險因素人群歸因危險度研究.pdf精彩內(nèi)容。