簡介：目的為了增加可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ與TNFΑ的親和力，對人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ脂聯(lián)素球部（STNFRⅡGAD）融合蛋白進(jìn)行改構(gòu)，構(gòu)建了融合基因人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ脂聯(lián)素球部FC（STNFRⅡGADFC）的真核表達(dá)載體，利用富含“GC”的方法代替DHFR擴(kuò)增體系，在CHOS細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了STNFRⅡGADFC快速高效表達(dá)，探索了無血清懸浮流加培養(yǎng)方法，為進(jìn)一步優(yōu)化一套高密度、高效表達(dá)該融合蛋白的大規(guī)模懸浮流加培養(yǎng)工藝打下良好基礎(chǔ)。方法1構(gòu)建PAAV2STNFRⅡGADFC和PMH3STNFRⅡGADFC表達(dá)質(zhì)粒通過PCR和重組PCR的方法，將人IGG1FC和STNFRⅡGAD基因片段重組，得到融合基因STNFRⅡGADFC。分別克隆至不同的真核表達(dá)載體PAAV2NEOCMVMCSPGKDHFR和PMH3中，構(gòu)建PAAV2STNFRⅡGADFC和PMH3STNFRⅡGADFC重組質(zhì)粒。2建立表達(dá)STNFRⅡGADFC的CHODHFR和CHOS細(xì)胞株脂質(zhì)體法將PAAV2STNFRⅡGADFC轉(zhuǎn)染至CHODHFR細(xì)胞中，電轉(zhuǎn)染法將PMH3STNFRⅡGADFC導(dǎo)入CHOS細(xì)胞中，G418篩選2周，得到穩(wěn)定表達(dá)的多克隆細(xì)胞株，單克隆化，斑點(diǎn)雜交和WESTERNBLOT分析STNFRⅡGADFC的表達(dá)。斑點(diǎn)雜交比較STNFRⅡGADFC在CHODHFR和CHOS細(xì)胞中的表達(dá)，選擇快速高效的富含GC的CHOS表達(dá)體系進(jìn)行蛋白的大量制備，3輪單克隆挑選，篩出穩(wěn)定高表達(dá)的CHOSPMH3STNFRⅡGADFC細(xì)胞株。3在CHOS細(xì)胞中制備STNFRⅡGADFC融合蛋白31貼壁培養(yǎng)將篩選的高表達(dá)單克隆在T75方瓶中貼壁培養(yǎng)，隨后分別換成不含F(xiàn)BS的DMEMF12和無血清培養(yǎng)基B001培養(yǎng)以收集上清。32懸浮培養(yǎng)①搖瓶中懸浮批次培養(yǎng)將高表達(dá)單克隆用無血清培養(yǎng)基B001懸浮馴化培養(yǎng)，得到適合懸浮生長的穩(wěn)定高表達(dá)工程細(xì)胞株。在搖瓶中依次進(jìn)行了60ML、120ML懸浮批次培養(yǎng)，即20106CELLSML的接種密度，120RPM，37℃恒溫振蕩持續(xù)培養(yǎng)。②轉(zhuǎn)瓶及生物反應(yīng)器中流加培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)規(guī)模從搖瓶擴(kuò)大到轉(zhuǎn)瓶，最終擴(kuò)到生物反應(yīng)器，在轉(zhuǎn)瓶和反應(yīng)器中分別進(jìn)行了200ML、3L的流加培養(yǎng)，即初始接種密度20106CELLSML，當(dāng)達(dá)到40106CELLSML以上時(shí)開始流加培養(yǎng)，以每日葡萄糖殘余量2GL左右作為流加體積的控制參數(shù)。4STNFRⅡGADFC融合蛋白的純化培養(yǎng)上清經(jīng)PROTEINA瓊脂糖親和法分離純化，收集洗脫峰，SDSPAGE和WESTEMBLOT分析。5STNFRⅡGADFC融合蛋白活性檢測MTT法檢測STNFRⅡGADFC融合蛋白中和TNFΑ殺傷L929細(xì)胞的活性。比較STNFRⅡGADFC、STNFRⅡGAD和STNFRⅡFC拮抗TNFΑ的能力的差異。結(jié)果1成功構(gòu)建PAAV2STNFRⅡGADFC和PMH3STNFRⅡGADFC表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建的PAAV2STNFRⅡGADFC和PMH3STNFRⅡGADFC重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定正確，DNA測序，在IGG1FE片段上存在2個(gè)突變位點(diǎn)，即其第90位和186位的GTC纈氨酸分別突變?yōu)锳TC異亮氨酸和GAC天冬氨酸，但后期實(shí)驗(yàn)表明這兩處的點(diǎn)突變并不影響蛋白的結(jié)構(gòu)與生物活性。2成功建立穩(wěn)定高表達(dá)STNFRⅡGADFC的CHODHFR和CHOS細(xì)胞株轉(zhuǎn)染的細(xì)胞經(jīng)過G418篩選及單克隆化，DOTBLOT分析，STNFRⅡGADFC在CHODHFR細(xì)胞中基礎(chǔ)表達(dá)量較低（10ΜGML左右），需要較長的MTX加壓提高表達(dá)量。而在CHOS細(xì)胞中，僅經(jīng)過一次單克隆挑選即可獲得75ΜGML的高表達(dá)單克隆。因而，選擇在CHOS細(xì)胞中表達(dá)該蛋白，經(jīng)過3次單克隆挑選，得到較純表達(dá)量高的單克隆以備后期大量培養(yǎng)。WESTERNBLOT分析，還原的STNFRⅡGADFC樣品，在大約75KDA處出現(xiàn)特異性條帶，非還原的樣品，僅分別在大約170KDA處和遠(yuǎn)大于250KDA處出現(xiàn)特異性條帶，提示STNFRⅡGADFC以二聚體和多聚體形式表達(dá)，無單體蛋白。3STNFRⅡGADFC融合蛋白的生產(chǎn)在T75方瓶中分別用不含F(xiàn)BS的DMEMF12和B001培養(yǎng)基培養(yǎng)67天，蛋白純化后產(chǎn)量分別大約為50MGL和75MGL。搖瓶中60ML、120ML批次培養(yǎng)7天，蛋白產(chǎn)量為100MGL和92MGL，轉(zhuǎn)瓶中200ML及反應(yīng)器中3L流加培養(yǎng)78天，蛋白產(chǎn)量為183MGL和205MGL。4STNFRⅡGADFC融合蛋白純化洗脫的蛋白經(jīng)SDSPAGE和WESTERNBLOT分析，證實(shí)是STNFRⅡGADFC融合蛋白，純度約95％。5STNFRⅡGADFC融合蛋白的活性STNFRⅡGADFC融合蛋白具有顯著抑制TNFΑ殺傷L929細(xì)胞的活性，且呈劑量依賴性。得到STNFRⅡGADFC，STNFRⅡGAD和STNFRⅡFC的ECS0分別為04904，03201和1075，比活分別是020107U，031107U，0093107U。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了STNFRⅡGADFC的真核表達(dá)載體，在CHODHFR細(xì)胞和CHOS細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。但在轉(zhuǎn)染的CHOS細(xì)胞中可快速篩選出高表達(dá)（75GML）單克隆細(xì)胞株，STNFRⅡGADFC融合蛋白以二聚體和多聚體形式分泌表達(dá)，該蛋白具有顯著抑制TNFΑ殺傷L929細(xì)胞的活性。最終利用CHOS細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了STNFRⅡGADFC融合蛋白懸浮批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)中高效表達(dá)，為建立一套高密度、高效表達(dá)該融合蛋白的懸浮流加培養(yǎng)中試工藝打下了良好基礎(chǔ)。

簡介：目的觀察內(nèi)毒素LPS和地塞米松DEX對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討肺泡巨噬細(xì)胞與炎癥的關(guān)系。方法用支氣管肺泡灌洗法分離培養(yǎng)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，設(shè)正常對照組PBS組、LPS組、DEX組，采用瑞氏姬姆薩染色觀察巨噬細(xì)胞形態(tài)，MTT法測巨噬細(xì)胞活力、透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡率、HOECHST染細(xì)胞核形態(tài)等技術(shù)檢測LPS和DEX對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。并應(yīng)用ELISA法分別測定各組培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞24小時(shí)后上清液中TNFΑ和IL10的含量。結(jié)果1瑞氏姬姆薩染色LPS組肺泡巨噬細(xì)胞體積大，漿豐富，胞核大，貼壁能力強(qiáng)，折光度好；DEX組肺泡巨噬細(xì)胞體積小，呈濃縮狀，胞漿少，胞核小，貼壁能力弱，易懸浮；PBS組肺泡巨噬細(xì)胞呈混合樣形態(tài)，可見圓形和成纖維狀細(xì)胞。2MTT法檢測結(jié)果示LPS組6H后巨噬細(xì)胞明顯活力增強(qiáng)P＜001；DEX組巨噬細(xì)胞活力在24小時(shí)明顯下降P＜005。3透射電鏡觀察到LPS組和PBS組，細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)均勻，細(xì)胞生長狀態(tài)好；DEX組可見形成凋亡小體，還可見凋亡細(xì)胞核固縮，細(xì)胞染色質(zhì)邊聚明顯，核膜表面凹凸不平，較明顯的核膜斷裂，胞質(zhì)濃縮減少更為明顯并可見大量電子密度高的核碎片、空泡、線粒體變圓、空泡化。4流式細(xì)胞術(shù)作周期分析計(jì)數(shù)凋亡區(qū)亞二倍體區(qū)細(xì)胞數(shù)量得出凋亡率，LPS組隨處理時(shí)間延長凋亡率減小，DEX組隨處理時(shí)間延長凋亡率升高。5HOECHST染色LPS組和PBS組細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光；DEX組染色呈陽性，可見核縮小變形，濃染致密的顆粒塊狀熒光。6DEX組24H上清液IL10的含量顯著升高P＜001，LPS組IL10的含量顯著降低P＜001；LPS組在24H上清液中TNFΑ含量明顯增加P＜005，DEX組上清液中TNFΑ含量明顯降低P＜005。結(jié)論LPS激活的肺泡巨噬細(xì)胞，有抗凋亡趨勢，有促炎效應(yīng)。DEX激活的肺泡巨噬細(xì)胞，有凋亡趨勢，導(dǎo)致炎癥消退。

簡介：研究背景腎細(xì)胞癌（RENALCELLCARCINOMA，RCC）是起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)的惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80％90％。，約占成人惡性腫瘤的2％3％。各個(gè)國家或者地區(qū)的發(fā)病率不同，發(fā)達(dá)國家發(fā)病率高于發(fā)展中國家，每年死于腎細(xì)胞癌的人數(shù)大約有10萬多例并且發(fā)病率還在逐年遞增。我國各地區(qū)腎癌的發(fā)病率差異也較大，據(jù)全國腫瘤防治研究辦公室和衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)信息中心統(tǒng)計(jì)我國試點(diǎn)市，縣19881997年腫瘤發(fā)病及死亡資料顯示腎癌的發(fā)病率和死亡率均有上升趨勢；男女比例約為21；城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)，發(fā)病年齡可見于各年齡段，高發(fā)年齡為5070歲。外科手術(shù)仍然是局部性腎癌的首選治療方法，然而對于轉(zhuǎn)移性腎癌尚無標(biāo)準(zhǔn)的治療方案仍采用內(nèi)科為主的綜合治療，極少數(shù)患者可通過外科手術(shù)而治愈。所以，研究腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理和治療方法已經(jīng)成為泌尿外科臨床治療中努力的方向。1988年國內(nèi)建成了首例體外培養(yǎng)的“人腎癌細(xì)胞系”。為人腎細(xì)胞癌的基礎(chǔ)和臨床研究提供了極其重要的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。但是隨著實(shí)驗(yàn)的不斷開展，需要對細(xì)胞系進(jìn)行不斷的體外傳代于是一些生物學(xué)特征會(huì)漸漸的改變或消失，所以不斷建立新的細(xì)胞系已經(jīng)成為研究腎細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理和探尋新的治療方法的重要環(huán)節(jié)。裸鼠，顧名思義為無毛鼠，于1962年由英國的CRIST發(fā)現(xiàn)。裸鼠體內(nèi)無胸腺，因此無法生成成熟的T淋巴細(xì)胞，所以具有免疫缺陷的特性。移植于裸鼠的人體腫瘤組織，因受到較小的排斥反應(yīng)而更容易生長存活。1969年，RYGAARD首次建立了裸鼠人結(jié)腸腺癌模型。目前為止世界上已經(jīng)建立了500種以上的人體腫瘤裸鼠模型。裸鼠現(xiàn)在已經(jīng)成為研究人體惡性腫瘤的生物學(xué)特性以及篩選針對相應(yīng)腫瘤的抗癌藥物的常用工具，其應(yīng)用范圍包括腫瘤學(xué)，免疫學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)以及藥理學(xué)等各項(xiàng)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)直接對裸鼠皮下進(jìn)行手術(shù)標(biāo)本組織塊的包埋移植法其移植的成功率要高于利用手術(shù)標(biāo)本組織塊直接培養(yǎng)法以及利用手術(shù)標(biāo)本組織塊制成腫瘤細(xì)胞懸液直接注射法，成為建立腫瘤細(xì)胞系的常用方法。因此本研究根據(jù)此方法成功建立了一株穩(wěn)定傳代的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系。目的利用腎癌病人手術(shù)標(biāo)本皮下包埋于裸鼠的方法建立裸鼠移植模型通過裸鼠間傳代及體外傳代培養(yǎng)的方法建立了一株新的人腎癌細(xì)胞系，并且初步對該細(xì)胞系進(jìn)行鑒定為進(jìn)一步的腎癌基礎(chǔ)研究提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。方?人腎癌原代細(xì)胞系的建立20082009年間共采集20例腎癌新鮮手術(shù)標(biāo)本，于手術(shù)后1H內(nèi)將每例標(biāo)本切取四塊05CM05CM05CM組織塊分別包埋于2只裸鼠的右后肢皮下及背部皮下連續(xù)鼠間傳代3次取移植瘤繼續(xù)體外培養(yǎng)傳代，連續(xù)傳110代。2人腎癌原代細(xì)胞系的生物學(xué)特性鑒定對得到的細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察，繪制細(xì)胞株生長曲線，細(xì)胞DNA含量測定，染色體核型分析，軟瓊脂集落形成率實(shí)驗(yàn)，刀豆球蛋白A凝集實(shí)驗(yàn)，白細(xì)胞介素6的生物活性測定及病理學(xué)檢查。結(jié)果1人腎癌原代細(xì)胞系的建立其中1只裸鼠皮下移植瘤生長繼續(xù)傳代腫瘤生長速度明顯加快。取移植瘤標(biāo)本行體外組織塊培養(yǎng)，連續(xù)傳110代后，得到人腎癌細(xì)胞株記為XJG9201。2人腎癌原代細(xì)胞系的生物學(xué)特性鑒定細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)分化程度均與原發(fā)腫瘤一致；染色體眾數(shù)為65；細(xì)胞群體倍增時(shí)間為382H；細(xì)胞周期分析G1期627％G2期112％S1期253％；軟瓊脂集落形成率為70％；當(dāng)?shù)抖骨虻鞍譇濃度為125ΜGML時(shí)細(xì)胞即發(fā)生明顯凝集；病理學(xué)檢查具有腎透明細(xì)胞癌的特征。結(jié)論1成功建立了一例腎癌原代細(xì)胞系XJG9201。2腎癌細(xì)胞系XJG9201與原發(fā)癌保持相同的生物學(xué)特性體外連續(xù)傳代1年以上傳115代。細(xì)胞形態(tài)不變生長周期恒定已成為一個(gè)穩(wěn)定的細(xì)胞系。

簡介：肝臟作為人體最大的實(shí)質(zhì)性臟器，在維持體內(nèi)新陳代謝中處于核心地位。肝組織的破壞，如慢性炎癥、纖維變等，往往造成全身性的、甚至是致命的代謝紊亂。但是，肝臟具有很強(qiáng)的再生能力，這可在一定程度上代償肝實(shí)質(zhì)的破壞。然而致病因素的長期存在（如慢性肝炎），往往導(dǎo)致肝再生的異常，最終引起肝實(shí)質(zhì)的結(jié)構(gòu)異常和功能喪失，危及患者生命。因此，掌握肝臟再生的調(diào)控機(jī)制，不但具有重要的理論意義，而且具有緊迫的臨床需求。肝臟損傷或肝部分切除后，剩余肝臟會(huì)代償性再生，肝臟再生的實(shí)質(zhì)是肝細(xì)胞的不斷增殖、擴(kuò)增。肝細(xì)胞增殖主要依靠肝細(xì)胞生長因子（HEPATOCYTEGROWTHFACT，HGF）和白細(xì)胞介素6（INTERLEUKIN6，IL6）的作用，而這兩種細(xì)胞因子主要由一類肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞（LIVERSINUSOIDALENDOTHELIALCELL，LSEC）分泌。肝再生的過程伴有大量LSEC的增殖和更新。因此，LSEC對于維系肝細(xì)胞的功能狀態(tài)進(jìn)而影響肝臟再生發(fā)揮著重要的作用。此外，LSEC所構(gòu)成的肝血竇又是肝臟微循環(huán)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，它的正常結(jié)構(gòu)對于維系肝臟功能至關(guān)重要。本課題我們將著重通過研究LSEC以及肝血竇的結(jié)構(gòu)和功能變化，來闡明其對于肝再生的基本作用和其中包含的分子調(diào)控機(jī)制。此外，既往研究已證實(shí)骨髓來源的干、祖細(xì)胞也參與到肝再生過程中。截至目前，尚無證據(jù)表明干、祖細(xì)胞可以直接分化為肝細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)肝再生。然而骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞（ENDOTHELIALPROGENITCELL，EPC）可以分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，這在多個(gè)組織、器官的損傷和修復(fù)過程中已被廣為證實(shí)。而肝再生過程中，骨髓來源的干、祖細(xì)胞也被證實(shí)參與LSEC的更新，它們可能直接分化為成熟的LSEC或通過旁分泌等途徑促進(jìn)LSEC乃至肝細(xì)胞的增殖。由此看來，肝再生的進(jìn)程可能是一個(gè)由肝細(xì)胞、LSEC等內(nèi)源性因素和由骨髓來源EPC等外源性因素共同作用的結(jié)果。深入闡明肝再生的機(jī)制，我們需要從這兩個(gè)方面著手研究。NOTCH信號途徑是人體最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其分子廣泛表達(dá)于胚胎和成年個(gè)體組織中，主要由表達(dá)于相鄰細(xì)胞上的NOTCH配體和NOTCH受體、以及表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子、下游分子和其他調(diào)節(jié)分子組成。RBPJ是激活NOTCH信號通路所必需的一個(gè)核心轉(zhuǎn)錄因子，它的缺失意味著NOTCH信號的完全阻斷。NOTCH信號途徑對細(xì)胞的分化、增殖、凋亡有重要的調(diào)控作用，它廣泛參與組織器官的發(fā)育、生長以及再生進(jìn)程，其功能的異常與很多疾病及腫瘤發(fā)生有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，肝再生的進(jìn)程伴有NOTCH信號通路分子的廣泛變化。NOTCH信號途徑對于維持肝臟的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。本課題我們首先利用小鼠肝部分切除模型模擬肝臟再生進(jìn)程，并利用RBPJ條件性基因剔除模型，研究了RBPJ介導(dǎo)的NOTCH信號途徑在肝再生過程中的具體調(diào)控作用主要是NOTCH信號通路如何通過調(diào)節(jié)LSEC和肝血竇的結(jié)構(gòu)和功能來調(diào)控肝細(xì)胞的功能狀態(tài)，進(jìn)而影響到肝再生進(jìn)程；以及NOTCH信號通路如何通過調(diào)節(jié)EPC的功能，從而影響LSEC、肝細(xì)胞的功能狀態(tài)，最終導(dǎo)致肝再生進(jìn)程的改變；此外，我們還深入探討了這其中所包含的具體分子機(jī)制，特別是NOTCH信號通過VEGF受體分子對LSEC的調(diào)控，以及NOTCH通過CXCR4對EPC的調(diào)控。我們的主要研究成果如下1、成功構(gòu)建了RBPJ條件性基因剔除的小鼠，即NOTCHRBPJ信號缺失的小鼠模型；2、我們發(fā)現(xiàn)NOTCH信號缺失會(huì)導(dǎo)致肝臟穩(wěn)態(tài)的喪失，具體表現(xiàn)為肝臟淤血樣改變，肝細(xì)胞、LSEC的異常增殖，正常肝小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞；3、我們發(fā)現(xiàn)阻斷NOTCH信號會(huì)導(dǎo)致肝再生功能的障礙，具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞、LSEC增殖能力減弱，肝臟失代償性增大，LSEC去分化，肝血竇阻塞，肝細(xì)胞合成、分泌白蛋白能力減弱；4、通過體外實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，NOTCH信號直接影響肝細(xì)胞、LSEC的細(xì)胞生物學(xué)活性，NOTCH信號缺失，會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞、LSEC的異常增殖，還會(huì)造成LSEC分泌VEGF、HGF、IL6的功能障礙；5、NOTCH信號會(huì)影響到肝再生進(jìn)程中，骨髓來源EPC向外周的動(dòng)員和向肝臟的定向募集，阻斷NOTCH信號會(huì)增加EPC向外周血的動(dòng)員，但動(dòng)員出的EPC更難于募集到再生的肝臟；6、NOTCH信號缺失的骨髓細(xì)胞無法正常參與到肝臟再生并促進(jìn)肝細(xì)胞、LSEC的增殖；7、NOTCH信號對于維持體外培養(yǎng)的骨髓EPC的細(xì)胞活性至關(guān)重要，阻斷該通路會(huì)導(dǎo)致EPC增殖、粘附、集落形成、遷移、成管腔能力的減弱；8、NOTCH信號對骨髓來源EPC的調(diào)控是通過CXCR4通路而實(shí)現(xiàn)的，外源性過表達(dá)CXCR4可以挽救NOTCH缺失后EPC喪失的成管腔能力。綜上所述，肝再生進(jìn)程是一個(gè)多細(xì)胞共同參與并相互作用的過程。NOTCH信號通路在此過程中扮演著重要角色，它可以直接調(diào)控肝細(xì)胞、LSEC的生物學(xué)活性，也可以通過影響骨髓EPC的功能，而改變肝再生的進(jìn)程。同時(shí)NOTCH信號途徑對于維持肝臟穩(wěn)態(tài)也至關(guān)重要。這些都為我們研究有關(guān)肝臟疾病的預(yù)防和治療奠定了重要的理論依據(jù)。

簡介：本研究分為二部分第一部分白血病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性研究目的了解白血病患者來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSC的生物學(xué)特性，從細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)志、細(xì)胞周期、多向分化、造血因子及腫瘤基因的表達(dá)等方面加以探討，為MSC的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1以密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，體外用低糖型DMEMF12培養(yǎng)基進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，通過細(xì)胞形態(tài)、免疫表型以及向成骨和脂肪細(xì)胞分化能力加以鑒定。2利用流式細(xì)胞儀對培養(yǎng)的MSC進(jìn)行表型測定、細(xì)胞周期分析。3以RTPCR檢測IL6、IL3、SCF和SDF1等細(xì)胞因子及白血病相關(guān)的腫瘤基因表達(dá)。4以放射免疫法檢測MSC培養(yǎng)上清中IL6、TNFA的含量。5取第3代MSC在含有造血因子的半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。結(jié)論1從白血病患者骨髓培養(yǎng)得來的MSC可于體外培養(yǎng)、傳代大量擴(kuò)增，保持低分化狀態(tài)，具有向脂肪以及成骨細(xì)胞分化的能力。2白血病患者來源MSC的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期、免疫表型等方面均與正常成人MSC相似，且不表達(dá)與造血系統(tǒng)腫瘤相關(guān)的癌基因。3白血病患者的骨髓MSC具有正常MSC的生物學(xué)特性，在臨床的細(xì)胞治療中有潛在應(yīng)用價(jià)值。第二部分ABO血型不合異基因造血干細(xì)胞移植后純紅細(xì)胞再生障礙分析目的分析異基因造血干細(xì)胞移植ALLOHSCT后純紅細(xì)胞再生障礙PRCA的病因、臨床特征、治療和轉(zhuǎn)歸。方法總結(jié)1991年8月至2005年3月我院治療的224例患者ALLOHSCT的臨床資料，分析受者年齡、供受者性別、移植方式、植入的有核細(xì)胞數(shù)、HLA配型、預(yù)處理方案含全身照射TBI不含TBI，移植物抗宿主病GVHD的預(yù)防含環(huán)孢菌素ACSA或不含CSA，受者抗供者凝集素類型，移植前供、受者乙型肝炎病毒HBV感染，ABO血型不合組受者血型O型或非O型等因素與PRCA發(fā)生的關(guān)系。觀察并分析10例ALLOHSCT后PRCA患者治療和轉(zhuǎn)歸。結(jié)論HSCT之前供、受者感染HBV及O型受者是ABO血型不合ALLOHSCT后PRCA發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

簡介：目的研究細(xì)胞因子HTGFΒ1對小鼠的淋巴細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及HTGFΒ1基因修飾的大鼠軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能的改變，初步探討其作用機(jī)制。為尋找理想的軟骨組織工程種子細(xì)胞、并開發(fā)新的異種移植排斥治療和預(yù)防方法奠定基礎(chǔ)。方法將HTGFΒ1細(xì)胞因子作用于小鼠淋巴細(xì)胞，利用熒光抗體標(biāo)記及ANNEXINV和7AAD雙染色，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測對多克隆刺激劑作用下的淋巴細(xì)胞CD69及CD25表達(dá)水平及ANNEXINV7AAD細(xì)胞比例，判斷T細(xì)胞的活化與凋亡水平；3HTDR同位素?fù)饺敕z測淋巴細(xì)胞的增殖情況。另一方面，利用優(yōu)化的電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將PEGFPTGFΒ1N1表達(dá)載體導(dǎo)入大鼠原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中，流式細(xì)胞儀檢測熒光表達(dá)率，熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，同位素?fù)饺敕z測軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能。結(jié)果小同劑量HTGFΒ1對于多克隆刺激劑作用的小鼠T細(xì)胞的活化較對照組均無明顯抑制作用；但可以抑制其增殖以及促進(jìn)活化誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡，并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞儀可以檢測到成功構(gòu)建的

簡介：中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文小鼠H22肝癌細(xì)胞肺高轉(zhuǎn)移株的建立及其生物學(xué)特性的測定和RHOC基因的表達(dá)姓名張璐申請學(xué)位級別碩士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師王士勇20100401結(jié)論建立了小鼠H22肝癌細(xì)胞肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株M4，M4轉(zhuǎn)移能力明顯增高、體外細(xì)胞生長速度快、倍增時(shí)間短、分裂期細(xì)胞比例多、染色體異型性明顯、細(xì)胞周期G悔L期比例較減少、S期比例增多。高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的RHOC基因MRNA的表達(dá)明顯增高；RHOC基因的過量表達(dá)與小鼠H22肝癌細(xì)胞的高轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。關(guān)鍵詞H22肝癌細(xì)胞；轉(zhuǎn)移；RHOC基因2

簡介：天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文CD9基因表達(dá)的變異對膀胱移行細(xì)胞癌生物學(xué)特性影響的研究姓名郭峰申請學(xué)位級別博士專業(yè)外科學(xué)（泌尿外）指導(dǎo)教師孫光暢繼武20060525

簡介：福建醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾介導(dǎo)PROHIBITIN基因沉默對人大腸癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響姓名程艷潔申請學(xué)位級別碩士專業(yè)病原生物學(xué)指導(dǎo)教師姚麗君20100301升高，S期比例NC477士875％、PHBL38334士0510％、PHB539317A191％；應(yīng)用ANNEXINVFITC細(xì)胞凋亡試劑盒流式檢測也同樣發(fā)現(xiàn)D2區(qū)顯示凋亡細(xì)胞比例增加，有統(tǒng)計(jì)意義P005CASPASE3活性度PHBL381500392、PHB53918110416，CASPASE9活性度PHBL382020435、PHB539281士0517。ANNEXINVFITC和HOECHST染色均在熒光顯微鏡下觀測有明顯的凋亡現(xiàn)象，且凋亡比例和強(qiáng)度比陰性對照強(qiáng)。結(jié)論靶向PHBSIRNA干擾可以有效的沉默大腸癌細(xì)胞PHB基因，下調(diào)PHB蛋白水平，從而抑制大腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)大腸癌細(xì)胞凋亡；實(shí)驗(yàn)篩選出沉默效果較好的兩個(gè)片段PHBL38、PHB539實(shí)驗(yàn)組，為后期丌展RNA體內(nèi)干擾實(shí)驗(yàn)提供理論、技術(shù)基礎(chǔ)；靶向干擾PHB基因?yàn)榇竽c癌基因治療研究提供理論依據(jù)。關(guān)鍵詞PROHIBITINSIRNARNA干擾4

簡介：目的探討2型糖尿病人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞MSCS的生物學(xué)特性并研究其增殖、凋亡、分化及旁分泌能力。用BRDU、DAPI、SPIO標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行體外示蹤。為MSCS治療2型糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人MSCS，傳代擴(kuò)增，倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原，添加誘導(dǎo)液誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化并加以鑒定。比較正常人和2型糖尿病人MSCS的增殖、凋亡、分化及旁分泌能力。BRDU、DAPI、SPIO進(jìn)行體外標(biāo)記并計(jì)算標(biāo)記率。結(jié)果密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法能有效分離純化MSCS，細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣，貼壁生長，以長梭形為主，細(xì)胞存活率均大于95％；流式細(xì)胞儀檢測MSCS表面抗原CD44、CD45、CD71、CD105SH2；誘導(dǎo)人骨髓MSCS向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化，T2DM與正常人的MSCS比較差異不顯著；MTT法檢測結(jié)果顯示在第16代兩組OD值差異不顯著P＞001；正常組分泌的HGF為13316±1421PG106個(gè)細(xì)胞，VEGF為1582±131PG106個(gè)細(xì)胞；T2DM細(xì)胞組分泌的HGF為13321±1552PG106個(gè)細(xì)胞，VEGF為14334±142PG106個(gè)細(xì)胞，兩組HGF比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞005T2DM組MSCS分泌的VEGF低于正常組P＜005。結(jié)論1、本實(shí)驗(yàn)通過PERCOLL密度梯度離心法和貼壁篩選是獲得較高純度和活性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的有效方法。2、2型糖尿病人MSCS的生長、增殖、分化及分泌能力與正常人相似，可以進(jìn)行自體移植治療。3、BRDU、DAPI、SPIO標(biāo)記是安全、有效、便捷的體外示蹤法。

簡介：復(fù)旦大學(xué)碩士學(xué)位論文膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)鑒定及生物學(xué)特性研究姓名崔大明申請學(xué)位級別碩士專業(yè)神經(jīng)外科指導(dǎo)教師車曉明20070401論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。論文中除了特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。其他同志對本研究的啟發(fā)和所做的貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的聲明并表示的謝意。作者簽名日期論文使用授權(quán)聲明本人完全了解復(fù)旦大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨颊撐牡膲静炕虿糠謨?nèi)容，町以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存論文。保密的論文在解密后遵守此規(guī)定。作者簽輻導(dǎo)師簽名ILL期

簡介：蘇9TI、19學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明．I749S1J本人鄭重聲明所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。論文作者簽名蘭至墾珥竺日蘇州大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解蘇州大學(xué)關(guān)于收集、保存和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)位論文著作權(quán)歸屬蘇州大學(xué)。本學(xué)位論文電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學(xué)有權(quán)向國家圖書館、中國社科院文獻(xiàn)信息情報(bào)中心、中國科學(xué)技術(shù)信息研究所含萬方數(shù)據(jù)電子出版社、中國學(xué)術(shù)期刊光盤版電子雜志社送交本學(xué)位論文的復(fù)印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索。涉密論文口本學(xué)位論文屬在年一月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文口論文作者簽名至紐紐絲．日導(dǎo)師期．沙／O叫期P71二墅型

簡介：蘇州大學(xué)碩士學(xué)位論文人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H446側(cè)群細(xì)胞的生物學(xué)特征姓名王波申請學(xué)位級別碩士專業(yè)腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師張軍寧20100501ABSTRACTBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFTHESIDEPOPULATIONOFHURNANSMALLCELLLUNGCANC蟹竺墮』墊E旦塹BIOLOGICALCHARACTERISTICSOFTHESIDEPOPULATIONOFHUMANSMALLCELLLUNGCANCERCELLLINEH446ABSTRACTOBJECTIVETHEAIMOFTHISSTUDYISTOIDENTIFYANDCHARACTERIZETHESIDEPOPULATIONSPCELLSINSMALLCELLLUNGCANCERSCLCCELLLINEH446，WHICHLAYTHEFOUNDATIONFORISOLATIONANDPURIFICATIONOFCSCMETHODSFLUORESCENCEACTIVATEDCELLSORTINGFACSWEREUSEDTOSORTSPANDNONSPNSPCELLSFROMH446BOTHSUBGROUPSWERECULTIVATEDTOSURVEYTHECAPABILITYOFREFORMINGINTOSUSPENDEDTUMORCELLSPHERESREVERSETRANSCRIPTIONPCRRTPCRANDREALTIMEPCRWEREUSEDTOEVALUATETHEMRNAEXPRESSIONLEVELSOFCD133，ABCG2ANDNUCLEOSTEMININBOTHSUBGROUPSTHECAPACITYOFPROLIFERATIONANDTHEDIFFERENCESINDRUGRESISTANCEOFBOTHSUBGROUPSANDUNSORTEDCELLSWASTESTEDBYMTTMETHODTHEDIFFERENTIATIONABILITYOFBOTHSUBGROUPSWASDETERMINEDBYFACSTHEPROLIFERATIONOFTHEMWASDETERMINEDBYSUBCUTANEOUSTUMORFORMATIONINNUDEMICERESULTS1THEPERCENTAGEOFHOECHST33342NEGATIVECELLSWASABOUT51402％INH446BYFLUORESCENCEMICROSCOPYTHEPERCENTAGEOFSPCELLSWAS6301％BYFLOWCYTOMETRY2SPCELLSHASSTRONGERCAPABILITYOFREFORMINGINTOTUMORSPHERESTHANNSPCELLS3THEMRNAEXPRESSIONLEVELSOFABCG2，CD133ANDNUCLEOSTEMININSPCELLSWERE2160A026，710X014AND102_L008FOLDHIGHERTHANTHOSEINNSPCELLSP0054INVIVO，SPCELLSSHOWEDABETTERPROLIFERATIVEABILITYANDTOUGHERVIABILITYWHENSUFFERINGWITHDRUGTREATMENT5SPCELLSCALLDIFFERENTIATEINTONSPCEILS，BUTNSPCANNOTDIFFERENTIATEINTOSPCELLS6SPCELLSHADAGREATERABILITYTOFORMTUMORCONCLUSIONⅡ

簡介：第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文P物質(zhì)對體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制的初步探討姓名孫應(yīng)明申請學(xué)位級別碩士專業(yè)口腔正畸學(xué)指導(dǎo)教師段銀鐘200051第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文P物質(zhì)對體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)及作用機(jī)制的初步探討研究生孫應(yīng)明導(dǎo)師段銀鐘教授第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科，西安中文摘要I在正畸牙齒移動(dòng)過程中，發(fā)現(xiàn)牙周內(nèi)P物質(zhì)表達(dá)明顯增強(qiáng)。二者L、之間存在著密切的聯(lián)系。但P物質(zhì)在正畸組織改建中發(fā)揮什么樣的作、用其機(jī)制如何目前還不清楚古／本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，觀察P物質(zhì)對體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞的影響，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，以期為闡明正畸組織改建中神經(jīng)調(diào)控的機(jī)理提供依據(jù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下1P物質(zhì)對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響采用細(xì)胞記數(shù)和MTT法觀察P物質(zhì)對人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖影響。白種檢測結(jié)果同時(shí)顯示P物質(zhì)促進(jìn)該細(xì)胞的增殖，并具有明顯的T濃度依賴性，其中LO。M的P物質(zhì)具有最大的刺激效應(yīng)，細(xì)胞數(shù)最大增加達(dá)20％；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SP受體拮抗劑SPANTIDE明顯抑制了P物質(zhì)對體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞促進(jìn)增殖的作用，提示P物質(zhì)對該細(xì)胞的2

簡介：目的用懸浮克隆培養(yǎng)技術(shù)在體外從胚胎和新生大鼠的側(cè)腦室下區(qū)海馬分離神經(jīng)干細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增傳代培養(yǎng)觀察其自我復(fù)制和多潛能分化特性結(jié)論1、消化液的消化能力0125﹪的胰蛋白酶對腦組織塊的分散能力最差不能滿足克隆培養(yǎng)時(shí)對細(xì)胞分散度的要求腦組織消化液I和腦組織消化液II的消化分散能力明顯強(qiáng)于0125﹪的胰蛋白酶消化液III對細(xì)胞的分散能力最強(qiáng)能夠滿足克隆培養(yǎng)對細(xì)胞分散度的要求2、DNA酶I對防止細(xì)胞重聚的作用DNA酶I沒有防止細(xì)胞重聚的作用細(xì)胞之間的重聚可能是細(xì)胞外基質(zhì)所致而非DN分子纏繞所致3、培養(yǎng)體系中絕大多數(shù)的細(xì)胞團(tuán)是由單細(xì)胞克隆增殖而來4、不同部位細(xì)胞形成初級神經(jīng)干細(xì)胞球的能力