雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠的制備及用于牙周組織再生的實驗研究.pdf

1、背景：牙周病是導(dǎo)致成年人失牙的主要原因之一，嚴(yán)重影響人類的身體健康和生活質(zhì)量。如何使已破壞的牙周支持組織重新修復(fù)再生是牙周病治療中的難點和熱點。目前廣泛開展的牙周骨移植、引導(dǎo)組織再生、引導(dǎo)骨再生等技術(shù)因植入材料缺乏主動誘導(dǎo)組織再生修復(fù)的能力，從而未能達(dá)到理想的牙周組織再生目標(biāo)；外源性生長因子的應(yīng)用具有激發(fā)牙周組織修復(fù)潛能的明確作用，但是，如何使生長因子持續(xù)高效發(fā)揮作用還未很好解決，從而使得外源性生長因子的應(yīng)用受到限制。此外，牙周再生手術(shù)

2、操作空間狹小、視野受限，復(fù)雜的操作通常難以進(jìn)行，這與大量的牙周組織再生需求反差強(qiáng)烈。還有，由于牙周組織所處的口腔環(huán)境因素，牙周再生手術(shù)術(shù)后易受污染而影響手術(shù)效果甚至導(dǎo)致手術(shù)失敗。 研究目的 本研究嘗試將最近幾年才被提出的新型載藥系統(tǒng)殼聚糖溫敏凝膠，結(jié)合環(huán)糊精包合技術(shù)，制備成能夠同時緩釋生長因子（rhBMP-2）和抑菌成分（氯己定）的載藥凝膠，應(yīng)用于牙周組織的修復(fù)再生。該載藥系統(tǒng)的特點是保存條件下以溶液狀態(tài)存在，并保持生理

3、中性，當(dāng)溫度達(dá)到37℃時立即發(fā)生相轉(zhuǎn)變，形成半固體凝膠。通過實驗，希望獲得具備生長因子和抑菌劑雙緩釋的功能性溫敏凝膠，并通過使用該凝膠系統(tǒng)獲得操作簡便并且術(shù)后感染率低、組織修復(fù)再生效果好的牙周組織再生方法。 方法與結(jié)果 1．殼聚糖溫敏凝膠的制備與性能 用不同濃度的殼聚糖溶液和β-甘油磷酸鈉溶液制備溫敏凝膠，測量其在37℃時膠凝的時間，優(yōu)選制備工藝，通過軟固體測量儀、旋轉(zhuǎn)粘度儀、掃描電鏡以及高效液相技術(shù)等測量凝膠的

4、強(qiáng)度、穩(wěn)定性、降解性、體外釋放骨形態(tài)發(fā)生蛋白替代物以及體外釋放氯己定的效能，并通過細(xì)胞實驗觀察殼聚糖溫敏凝膠與牙周膜細(xì)胞的相容性。 結(jié)果顯示，2％殼聚糖（脫乙酰度為91％）與12％的β-甘油磷酸鈉配置時獲得了性狀良好的殼聚糖-甘油磷酸鈉溫敏凝膠系統(tǒng)。溶液pH值為7.11±0.03，在37℃條件下，溶液經(jīng)8min轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的半固體凝膠。凝膠強(qiáng)度為（4.6±0.3）×104 Pa，接近于1.5％瓊脂糖凝膠。在凝膠中加載骨形態(tài)發(fā)生蛋白

5、的操作簡便，凝膠對蛋白具有較好的緩釋效能，緩釋作用長達(dá)一月以上。凝膠內(nèi)直接加載氯己定不能獲得氯己定的緩釋，氯己定在10余小時即釋放完畢。細(xì)胞實驗表明，體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞可以方便的加載于凝膠中，并在其中伸展，顯示殼聚糖溫敏凝膠有較好的細(xì)胞相容性。 2．雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠的制備及性能 通過飽和水溶液法制備β-環(huán)糊精與氯己定的包合物，并通過掃描電鏡、紅外光譜掃描、紫外光譜掃描鑒定包合物的性質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，共混包合物以及骨

6、形態(tài)發(fā)生蛋白替代物于殼聚糖溫敏凝膠中，對比檢測加載包合物前后凝膠的膠凝特性、穩(wěn)定性以及在同一體系內(nèi)對氯己定和骨形態(tài)發(fā)生蛋白替代物的緩釋效能。 結(jié)果顯示：通過鑒定，成功獲得β-環(huán)糊精與氯己定的包合物。包合率為40.11％。目標(biāo)藥物共混于殼聚糖溫敏凝膠之后，凝膠系統(tǒng)仍然能夠在37℃時形成穩(wěn)定凝膠，對蛋白藥物的緩釋效能未發(fā)生變化，而對氯己定的緩釋作用明顯增強(qiáng)，緩釋時間長達(dá)一月以上。 3．雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠用于牙周組織再生的實

7、驗研究 制備犬前磨牙Ⅱ度根分叉牙周組織缺損模型，先行嚴(yán)密縫合組織瓣，然后分五組于牙周組織缺損處分別注入①加載氯己定/β-環(huán)糊精包合物和rhBMP-2的殼聚糖溫敏凝膠（T1組）②加載rhBMP-2的殼聚糖溫敏凝膠（T2組）③加載氯己定/β-環(huán)糊精包合物的殼聚糖溫敏凝膠（T3組）④單純殼聚糖溫敏凝膠（C1組）⑤不注射任何藥物（C0組）。術(shù)后不使用抗生素，常規(guī)護(hù)理，8w后對實驗犬進(jìn)行插管灌注固定，取材，大體及組織學(xué)切片觀察牙齦炎癥情況

8、及牙周缺損處的組織再生情況。 結(jié)果顯示：應(yīng)用殼聚糖溫敏凝膠，可以方便地通過注射方式局部安放載體。而且，T1組、T2組獲得明顯的牙周組織再生；牙齦炎癥細(xì)胞浸潤情況顯示T1組及T3組炎細(xì)胞數(shù)量明顯少于其他組。而且，T1組較T2和T3組有更好的組織再生結(jié)果。表明殼聚糖溫敏凝膠作為載體在用于牙周組織缺損的再生治療時有效發(fā)揮了rhBMP-2和氯己定各自的作用。初步證明，rhBMP-2和氯己定雙緩釋殼聚糖溫敏凝膠用于牙周組織再生治療具有簡便

9、性和有效性，而且，雙緩釋rhBMP-2和氯己定較僅緩釋其中一種促進(jìn)組織再生的效果更好。 4．殼聚糖化學(xué)固載環(huán)糊精新材料的研究 通過化學(xué)合成方法，將環(huán)糊精分子化學(xué)結(jié)合到殼聚糖分子的羥基（保留殼聚糖分子的氨基）上，制備殼聚糖固載環(huán)糊精的新材料，旨在獲得更好的雙緩釋載體材料。通過紅外光譜分析及核磁共振分析進(jìn)行新材料鑒定。 結(jié)果：合成的新材料為淡黃色固體粉末，紅外測定結(jié)果與核磁共振譜測定結(jié)果表明，環(huán)糊精分子固載于殼聚糖的

10、羥基上，β-環(huán)糊精表觀固載量經(jīng)測定為42％。合成反應(yīng)總收率為29％。新材料兼有殼聚糖和β-環(huán)糊精的雙重結(jié)構(gòu)及特性，可望成為新型雙緩釋載體材料應(yīng)用于生物材料領(lǐng)域。 結(jié)論 1．通過共混rhBMP-2和氯己定/β-環(huán)糊精包合物可以獲得rhBMP-2與氯己定雙緩釋的殼聚糖溫敏凝膠，該系統(tǒng)在4℃條件下呈穩(wěn)定的溶液狀態(tài)，37℃時經(jīng)8min轉(zhuǎn)化成半固體凝膠，緩釋rhBMP-2與氯己定一月以上，與牙周膜細(xì)胞相容，可生物降解，應(yīng)用于根分叉