PICK1蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蛋白激酶Cα相互作用蛋白(protein interacting kinase，PICK1.)with Cα，是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα，PKCα)的靶蛋白之一，也是在PKCα和突觸后膜受體蛋白間起重要作用的銜接蛋白，迄今為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PICK1和40多種蛋白相互作用，在突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、外周神經(jīng)感覺(jué)、細(xì)胞生長(zhǎng)等方面均發(fā)揮重要作用。PICK1蛋白一般包含PDZ結(jié)構(gòu)域、BAR結(jié)構(gòu)域以及兩個(gè)位于末端的酸性氨基酸

2、區(qū)。
　　PDZ結(jié)構(gòu)域作為一種重要的蛋白與蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞內(nèi)的許多重要的生理功能。本文圍繞PICK1中PDZ結(jié)構(gòu)域開(kāi)展以下工作。首先將小鼠來(lái)源的PICK1中編碼PDZ結(jié)構(gòu)域基因序列及其C44/G，C46/G，C44，46/GG的PDZ突變基因，克隆至經(jīng)改造的表達(dá)載體pETM-3C，并在E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá)，重組表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA，PreScission Protease(PPase)酶切，Seph

3、acryl S-200凝膠層析獲得電泳純的重組PDZ及其突變體蛋白。進(jìn)一步利用還原與非還原SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、分子排阻、熒光光譜、蛋白晶體衍射以H2O2氧化誘導(dǎo)等方法分析，結(jié)果顯示氧化條件對(duì)PICK1_ PDZ結(jié)構(gòu)域有明顯的影響，可引起PICK1_PDZ結(jié)構(gòu)域二聚化，介導(dǎo)二聚體形成的原因在于PDZ上Cys44，Cys46與對(duì)應(yīng)的PDZ上相應(yīng)位點(diǎn)形成鏈間二硫鍵，而且Cys44比Cys46對(duì)氧化條件更為敏感。另外，氧化引發(fā)的PDZ二

4、聚化會(huì)明顯削弱其與受體亞基GluR2及膜脂的結(jié)合。在細(xì)胞內(nèi)氧化也可誘導(dǎo)PICK1蛋白通過(guò)Cys44與Cys46形成分子間的二硫鍵。這些結(jié)果提示，氧化-還原可能會(huì)是調(diào)節(jié)PICK1蛋白眾多生理功能的一種機(jī)制。
　　其次將包含N端酸性區(qū)域以及PDZ結(jié)構(gòu)域基因編碼序列插入pET-gst載體，在此基礎(chǔ)上，利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得酸性區(qū)不同位點(diǎn)突變的NPDZ（包括PDZ結(jié)構(gòu)域上游1-20氨基酸殘基）(D4D6/AA，D8/A，Ei0E11/AA，

5、D12/A，D8D12/AA)的重組子。轉(zhuǎn)入E.coli BL21中進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GST-Sepharose4B親和層析和PreScissionProtease(PPase)酶切，Sephacryl S-200凝膠層析獲得了電泳純的NPDZ及其突變體蛋白。利用熒光光譜以及蛋白脂質(zhì)覆蓋法進(jìn)一步分析N端酸性區(qū)以及Ca2+對(duì)PDZ結(jié)構(gòu)域脂質(zhì)結(jié)合的影響，揭示N末端酸性氨基酸存在會(huì)顯著削弱PDZ與脂質(zhì)的結(jié)合，其中D8，D12天冬氨酸殘基是引