集胞藻PCC6803基因slr2049定點(diǎn)突變及其體內(nèi)重組功能研究.pdf

1、2006年,Zhao等在魚腥藻Anabaenasp.PCC7120中發(fā)現(xiàn)了一種色素裂合酶基因cpeS(編號(hào)為alr0617),該基因編碼的色素裂合酶CpeS可以催化藻藍(lán)膽素(PCB)連接到藻藍(lán)蛋白或者藻紅藍(lán)蛋白的β亞基Cys-84位點(diǎn)上。經(jīng)過同源軟件的分析,在集胞藻Synechocystissp.PCC6803中,找到了基因slr2049,它和基因cpeS具有很高的同源性。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)基因slr2049的功能有了初步的研究,證明該基因

2、所編碼蛋白是具有與其同源蛋白CpeS有相似的功能,即也是一種色素裂合酶。
　　為了進(jìn)一步的對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系有深刻的了解,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù),對(duì)蛋白Slr2049的某些氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變。針對(duì)的氨基酸位點(diǎn)是通過比對(duì)軟件,讓Slr2049和其他六種有相同功能的蛋白CpeS蛋白序列進(jìn)行對(duì)比,得到的22個(gè)保守性的氨基酸位點(diǎn)中選取八個(gè),選取這些氨基酸位點(diǎn)同時(shí)也考慮它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與理化性質(zhì)。在大腸桿菌中合成具有熒光性的藻藍(lán)

3、蛋白β-亞基的需要另外的3個(gè)相關(guān)基因:血紅素加氧酶1基因(ho1),藻藍(lán)素鐵氧還蛋白還原酶基因(pcyA)以及脫輔基蛋白β亞基基因(cpcB)。首先通過改進(jìn)的提取DNA的方法來提取集胞藻PCC6803的總DNA,再設(shè)計(jì)引物同時(shí)在引物上加入相應(yīng)的酶切位點(diǎn),進(jìn)行PCR得到目的片段;構(gòu)建野生型slr2049和八個(gè)突變體slr2049以及上述三個(gè)相關(guān)基因的克隆質(zhì)粒,將以上的這些基因兩兩結(jié)合構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pCDF-cpcB-slr2049野生型和

4、八個(gè)pCDF-cpcB-slr2049突變體以及pET-ho1-pcyA,然后將野生型和突變體的表達(dá)質(zhì)粒分別與pET-ho1-pcyA共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21體內(nèi),讓它們進(jìn)行異源體內(nèi)重組,通過IPTG的誘導(dǎo),得到了重組蛋白;由于載體上自帶了組氨酸標(biāo)記,得到的野生型重組蛋白和突變體的重組蛋白可用鎳柱親和層析的方法進(jìn)行純化,再把它們分別進(jìn)行光譜測(cè)定。
　　SDS-PAGE和光譜測(cè)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,野生型slr2049和突變體slr20

5、49(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2049(G84S)/slr204-9(Y124S)催化的重組蛋白分別在623nm和640nm左右有最大吸收峰和熒光發(fā)射峰,與天然的蛋白的最大吸收峰和熒光發(fā)射峰分別在625nm和645nm相近;而突變體slr2049(A24S)/slr2049(R107S)所催化的重組蛋白則沒有出現(xiàn)最大吸收峰和熒光發(fā)射峰;突變體slr2049(L

6、23S)/slr2049(W72L))/slr2049(G84S)所催化的重組蛋白雖然有吸收峰,但是吸收峰處的最大值與野生型slr2049催化的重組蛋白的吸收峰值相比明顯要小很多?？芍吧蛃lr2049和突變體slr2049(H21S)、slr2049(L23S)、slr2049(A24S)、slr2049(F25S)、slr2049(W72L)、slr2049(G84S)、slr2049(R107S)、slr2049(Y124S)之

7、間是有光譜吸收峰值差異的,這可以說明這八個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)催化形成藻藍(lán)蛋白β亞基的能力也是有差異的。從光譜圖上可說明24、107位的丙氨酸和精氨酸是色素裂合酶必需氨基酸,是其酶活中心;21、25、124位的組氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸對(duì)色素裂合酶的催化作用無明顯影響,不是必需氨基酸;23、72、84位的亮氨酸、色氨酸和甘氨酸是色素裂合酶催化作用的關(guān)鍵位點(diǎn),這三個(gè)氨基酸的突變能影響它的活性,降低它的催化能力。造成這一差異可能的原因是氨基酸的定點(diǎn)突變

8、能造成蛋白的結(jié)構(gòu)和溶解性改變,從而影響了蛋白的催化能力。
　　為了了解上述的重組蛋白是否是有效表達(dá)的,同時(shí)證明另外兩個(gè)突變體有沒有進(jìn)行有效的表達(dá),用特殊制作的一抗,進(jìn)行Westernblot反應(yīng)。通過SDS-PAGE和Westernblot技術(shù)對(duì)各表達(dá)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)和驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn),由野生型slr2049和突變體slr2049(H21S)/slr2049(L23S)/slr2049(F25S)/slr2049(W72L)/slr2