集胞藻PCC6803高效合成三羥基丙酸(3-HP)及其對異源途徑代謝響應機制的研究.pdf

1、作為一種重要的平臺化合物，三羥基丙酸(3-HP)的應用非常廣泛。目前三羥基丙酸主要是依靠化學合成的方法進行生產，這將對環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展產生不利影響。藍細菌擁有可以直接固定CO2的能力，使其成為適合燃料以及化學品生產的自養(yǎng)型微生物“細胞工廠”。在本研究中，我們在藍細菌集胞藻Synechocystis sp.PCC6803中構建了三羥基丙酸的生物合成途徑，并通過以下方法對該生物合成系統(tǒng)進行了優(yōu)化:1）使用不同啟動子提高丙二酰輔酶A還原酶

2、(MCR)基因表達量以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化;2）過表達乙酰輔酶A羧化酶和生物素?；富蛱岣咔绑w物丙二酰輔酶A產量;3）過表達NAD(P)轉氫酶基因改善NADPH供應;4）通過敲除PHA以及乙酸合成競爭通路使得碳源更多的流入3-HP合成通路。通過優(yōu)化，經過6天的培養(yǎng)Synechocystis中3-HP產量可以達到837.18mg L-1(348.8mg/g細胞干重)。另外，過表達來自魚腥藻Anabaena sp.PCC7120和聚球藻Syn

3、echococcus sp.PCC7942中核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶基因并沒有增加3-HP產量，這表明CO2固定也許并不是影響3-HP的生物合成的主要因素。
　　目前對于藍細菌細胞內部3-HP生物合成對代謝的響應機制的研究尚無報道。為此，在Synechocystis中成功構建了3-HP代謝通路后，我們利用同位素標記相對和絕對定量技術與液相二級質譜聯(lián)用技術(iTRAQ-LC-MS/MS)對3-HP生產株與野生型中蛋白表達

4、譜進行了比較。經過比對，蛋白組分析共檢出2，264個獨立蛋白，占Synechocystis基因組預測蛋白總數的63％。在所有檢測到的蛋白中上調蛋白為204個，下調蛋白為123個。我們還利用液相色譜與質譜聯(lián)用技術(LC-MS)對細胞內24種重要中心代謝物進行了檢測，綜合蛋白組學與代謝組學的數據可以看出Synechocystis中有關光合作用，氧化磷酸化作用，中心碳代謝過程的蛋白質以及轉運結合蛋白，蛋白翻譯過程，細胞調控過程的蛋白以及中心碳

5、代謝過程中24種重要代謝物中有14種代謝物上調。綜合蛋白組和代謝組的數據我們發(fā)現(xiàn)向集胞藻中引入外源3-HP合成途徑后，由于大量生產3-HP，細胞需要通過代謝調控機制對系統(tǒng)內所消耗的前體物以及能量、還原力進行補充，并通過自我調節(jié)降低3-HP產生毒性的影響，以保證了細胞在正常生長。我們還通過RT-qPCR分析和相關基因的過表達對蛋白組數據以及代謝調控機制進行了驗證，結果進一步證明了蛋白組數據的可靠性以及機理分析的準確性。通過對3-HP生產株