嘌呤能受體P2X5和P2X1在小鼠中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的表達(dá).pdf

1、近些年來，眾多的研究從分子、細(xì)胞和系統(tǒng)水平表明，細(xì)胞外ATP通過作用于P2嘌呤能受體在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。過去的十年，我們對于該類受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能有了越來越多的認(rèn)識，研究發(fā)現(xiàn)它們在細(xì)胞增值、細(xì)胞遷移、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和分化、細(xì)胞的死亡和生存中都發(fā)揮著一定的作用。
　　 P2嘌呤能受體由兩大家族組成:離子通道型P2X家族(P2X1-7)和G蛋白偶聯(lián)受體P2Y家族(P2Y1，2，4，6，11，12，

2、13，14)。已有一些工作初步研究了大鼠胚胎發(fā)育過程中P2X家族和P2Y家族在腦中的表達(dá)情況，然而除了P2X3和P2Y1亞型外，對于其他亞型的研究還較少。
　　 P2X5受體存在于多種脊椎動物中。既往的研究發(fā)現(xiàn)該類受體主要分布在皮膚、腸道、膀胱、胸腺和脊髓等部位的處于增值狀態(tài)的細(xì)胞中，主要作用是參與抑制細(xì)胞增值從而促進(jìn)細(xì)胞分化。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中涉及大量的細(xì)胞增值、細(xì)胞分化等生理過程，提示P2X5受體可能參與了此過程。
　

3、　 我們的工作首先分析了小鼠出生前的四個時間點(E9、E11、E13、E17)的腦提取物中P2X5受體的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。利用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在四個時間點均可以在323bp位置檢測到明顯的條帶，表達(dá)量也存在明顯的變化趨勢——從E9到E13逐漸增加，從E13到E17逐漸下降。利用蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn)，從E9開始在35KD位置均能檢測到單一條帶，表達(dá)量也呈現(xiàn)從E9到E13逐漸增加而從E13到E17逐漸下降的趨勢。
　　 在

4、小鼠出生前的五個時間點(E8、E9、E11、E13、E17)取材進(jìn)行免疫組織化學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)管剛剛形成的E8時就可以檢測到P2X5的存在，該強(qiáng)烈的陽性信號主要分布在神經(jīng)上皮層。在E11時，后腦、中腦和前腦區(qū)域均發(fā)現(xiàn)很強(qiáng)的陽性染色。但隨著腦的發(fā)育，陽性信號逐漸局限在新生神經(jīng)元開始分化的皮質(zhì)板位置。同樣在脊髓處，可以發(fā)現(xiàn)相似的表達(dá)情況。在E9時，陽性信號在整個脊髓區(qū)域都可以檢測到;但隨著發(fā)育的進(jìn)行，陽性信號逐漸局限到腹側(cè)角位置。

5、　　 先前的工作發(fā)現(xiàn)P2X5受體在成體哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在神經(jīng)元中，因此我們使用神經(jīng)元的標(biāo)記物TUJ-1抗體進(jìn)行免疫雙標(biāo)實驗以確定P2X5陽性細(xì)胞的類型。在E8時的神經(jīng)管中，只有極少量（不到5％）的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標(biāo)，同樣在E9時的脊髓中發(fā)現(xiàn)了相似的情況。然而，在E11時的皮質(zhì)板和腹側(cè)角區(qū)域，絕大多數(shù)P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標(biāo)。
　　 在小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中，從E9時開始發(fā)現(xiàn)P2X

6、5受體均一地表達(dá)在DRG神經(jīng)元中，而且所有的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標(biāo)。在E11時視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞層和視神經(jīng)中均可以檢測到P2X5受體的強(qiáng)信號，而且絕大多數(shù)的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標(biāo)。在腸道中，所有的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標(biāo)。在嗅上皮中也檢測到P2X5受體的強(qiáng)信號。另外，很強(qiáng)的P2X5陽性信號也存在于內(nèi)耳和前肢骨骼肌上散在的神經(jīng)纖維中。
　　 既往的研究發(fā)現(xiàn)ATP等激動劑刺激P2X5

7、受體僅能產(chǎn)生極小的電流，但是該受體與P2X1受體形成的異源多聚體P2X1/5卻具有對于ATP的高敏感性、不易敏化等特點。為了研究P2X5受體的生理功能，我們首先需要確定在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中P2X5受體是否可以與P2X1受體形成異源多聚體。我們也利用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)等技術(shù)研究了P2X1受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程(E11、E14、P0、P21)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)該受體從E11時開始表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中。這種分布上

8、的重疊現(xiàn)象提示兩受體之前存在形成異源多聚體的可能性。進(jìn)一步利用免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，P2X1和P2X5可以共沉淀。這些實驗提示P2X5受體可能與P2X1受體形成異源多聚體來發(fā)揮生理功能。
　　 本研究首次報道了神經(jīng)發(fā)育過程中P2X5受體和P2X1受體在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)P2X5受體在神經(jīng)發(fā)育的早期階段一過性的高表達(dá)，并逐步局限到新生神經(jīng)元中，并發(fā)現(xiàn)P2X5受體和P2X1受體可能以P2X1/5異源多聚體的形式發(fā)揮作