小麥高效PGPR菌的篩選鑒定及多色FISH檢測(cè)促生菌在根部的定殖.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)篩選和鑒定了高效的具有特異親和性的小麥根際促生菌并研究小麥根際菌在根部的定殖動(dòng)態(tài)。通過(guò)使用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的小麥凝集素為介導(dǎo)工具篩選小麥根際促生菌。共獲得32株與小麥凝集素具有親和性染色的高效根際菌，分別為固氮菌17株，解磷細(xì)菌4株，解鉀細(xì)菌11株。通過(guò)生理生化鑒定，大部分菌落呈白色和乳白色，WS17菌株的菌落顏色呈蛋黃色。17株菌為革蘭氏陰性菌，15株菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，31菌菌具有接觸酶的活性。其中，27株菌具有淀

2、粉酶活性，有3株菌的M.R.實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，4株菌的V.P.實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性，有9株菌可以產(chǎn)硫化氫，8株菌能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸。大部分菌株可以利用單糖和多糖為唯一碳源。對(duì)篩選獲得的代表菌株進(jìn)行了16S rRNA基因序列的分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹主要由芽孢桿菌、假單胞菌和節(jié)桿菌等7個(gè)種屬構(gòu)成組成。其中最主要的類群是芽孢桿菌屬(Bacillus)和節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。
　　 根際促生菌具有促生特性，對(duì)植物的生長(zhǎng)具有重要作用

3、，因此鑒定和分析32株菌的促生特性，如產(chǎn)吲哚乙酸、鐵載體、溶磷活性和抑制霉菌的能力是獲得高效根際菌的重要參考指標(biāo)。篩選獲得的32株中，有21(65.6％)株菌產(chǎn)吲哚乙酸，其中3株菌的產(chǎn)量超過(guò)80mg/1，菌株WS12產(chǎn)量最高為103.3mg/1。鐵載體的檢測(cè)采用平板法和液體培養(yǎng)法。32株菌在采用平板法檢測(cè)時(shí)，只有5株菌具有鐵載體活性，表現(xiàn)為菌落周圍有黃色暈圈。采用液體培養(yǎng)法時(shí)，產(chǎn)鐵載體菌株的培養(yǎng)基顏色變成淡黃色。通過(guò)使用CAS反應(yīng)檢測(cè)，

4、19(59.3％)株菌可以產(chǎn)鐵載體，12株菌的產(chǎn)量達(dá)到5+的水平。說(shuō)明采用液體培養(yǎng)測(cè)定菌株的產(chǎn)鐵載體活性更具靈敏性。平板法可能由于使用的產(chǎn)鐵載體固體培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)具有一定的抑制作用。31(96.8％)株菌株具有溶磷活性，溶磷能力在9.38.57.5μg/ml之間，其中菌株WS31溶磷活性最高為57.77±1.03μg/ml。雖然這些菌株篩選自不同培養(yǎng)基，但均具有溶磷活性。檢測(cè)了32株菌抑制植物病原真菌的能力，發(fā)現(xiàn)大部分菌株不具備抑制能

5、力，菌株WS07對(duì)4種具有明顯的抑制作用。菌株WS07對(duì)小麥赤霉病(Fusarium Graminearum)抑制率最大，達(dá)到51.40％，對(duì)棉花枯萎病菌(F.oxysporum)和玉米小斑病菌(Bipolaria maydis)，分別為41.03％和39.32％，對(duì)水稻紋枯病菌(Phizoctonia solani)的抑制作用達(dá)到37.7％。因此菌株WS07表現(xiàn)出較好的抑制植物病原真菌的效果。測(cè)定菌株的促生長(zhǎng)特性對(duì)微生物肥料的開發(fā)和應(yīng)

6、用具有重要的研究?jī)r(jià)值。
　　 采用大試管培養(yǎng)法測(cè)定了32株菌對(duì)小麥幼苗早期生長(zhǎng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的菌液對(duì)小麥的生長(zhǎng)具有顯著性的促進(jìn)作用。其中21株菌明顯促進(jìn)小麥次生根的生長(zhǎng)；22株菌對(duì)小麥的株高具有促進(jìn)作用；23株菌可以促進(jìn)小麥的根長(zhǎng)。接種32株菌，有11株菌對(duì)小麥的莖鮮重具有促進(jìn)作用。17株菌增加了小麥的根鮮重。10株菌增加小麥莖干重，19株增加小麥根干重。在32株菌株中對(duì)小麥的主根數(shù)、側(cè)根數(shù)、株高、根長(zhǎng)、總鮮重、根鮮

7、重、莖干重和根干重具有促進(jìn)作用的比例分別達(dá)到15.62、65.62、68.75、71.87、34-37、53.12、31.25和59.37％；上述的促進(jìn)作用均在p=0.05水平上達(dá)到顯著性差異。菌株促生作用主要表現(xiàn)在明顯提高小麥生長(zhǎng)的幾個(gè)主要指標(biāo)，如小麥的側(cè)根數(shù)、株高、根長(zhǎng)和根干重等。將促生結(jié)果與細(xì)菌的生理活性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)若細(xì)菌(65.6％)具有越多種類的促生生理活性，則越多種類的小麥生長(zhǎng)指標(biāo)得到顯著提高，說(shuō)明細(xì)菌的促生生理活性對(duì)植物

8、的生長(zhǎng)具有重要的促進(jìn)作用。考察細(xì)菌對(duì)小麥生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可以為微生物肥料的開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。
　　 通過(guò)使用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pTR102轉(zhuǎn)入菌株WS32中，用于研究該菌株在小麥根表的吸附情況。電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移頻率為3.55×10-5～4.14×10-5，獲得的標(biāo)記菌株WS32-L具有發(fā)光活性和tet、km和ch1三種抗性，菌株WS32-L的luxAB基因標(biāo)記的丟失率為19.7％，說(shuō)明luxAB基因具有穩(wěn)定遺傳的特性。因此，在根際微生物的研

9、究中可使用luxAB基因標(biāo)記技術(shù)來(lái)獲得具有抗性且易檢測(cè)的菌株，進(jìn)而更有效地研究根際微生物在植物根部的定殖過(guò)程。
　　 細(xì)菌吸附于小麥根表是形成定殖的必要條件，因此菌株WS32-L被用來(lái)研究在小麥根表的吸附動(dòng)力學(xué)過(guò)程。菌株WS32-L在接觸小麥幼根的瞬間就開始吸附，在60min內(nèi)達(dá)到吸附的飽和值7.85±0.0841gCFU/g。WS32-L在小麥幼根的吸附符合等溫吸附曲線。經(jīng)計(jì)算WS32-L在小麥幼根的最大吸附量為6.4.7×1

10、08 CFU/g，吸附系數(shù)α=4.5×10-9。小麥幼根經(jīng)過(guò)小麥凝集素的處理后可以提高菌株WS32-L在小麥根部的吸附量，與對(duì)照相比較差異達(dá)到顯著性水平(P=0.01)。經(jīng)過(guò)熱處理的小麥凝集素失去生理活性，不能提高WS32-L在小麥根表的吸附量。由此可見，小麥凝集素在細(xì)菌吸附過(guò)程中具有重要介導(dǎo)的作用。研究細(xì)菌吸附于小麥根表的過(guò)程對(duì)理解微生物在植物根部的定殖具有指導(dǎo)意義。
　　 FISH是研究根際微生物有效的檢測(cè)技術(shù)。設(shè)計(jì)種屬特異

11、性探針，研究了根際促生菌(Bacillus sp.WS24.和Pseudomonas sp.WS32)在小麥根表的定殖動(dòng)態(tài)。設(shè)計(jì)的探針具有種屬特異性，可檢測(cè)到目的菌株。使用溶菌酶處理芽孢桿菌WS24菌株提高了FISH撿測(cè)的靈敏度。在不同菌株混合存在的條件下，不同的種屬探針可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)菌株。采用FISH檢測(cè)目的菌株在小麥根表定殖，發(fā)現(xiàn)大量菌體吸附在小麥根表和根毛部位，菌體沿根表細(xì)胞間隙縱向分布形成致密的生物膜；其中根毛區(qū)的細(xì)菌密度