麗蠅嗅覺共同受體Orco的克隆、鑒定及其功能研究.pdf

1、背景
　　昆蟲高度復(fù)雜而靈敏的嗅覺系統(tǒng)用于識別環(huán)境中特異的化學(xué)氣味分子。嗅覺在昆蟲的覓食、寄主定位、尋偶、產(chǎn)卵等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。對嗅覺分子機制的研究揭示了氣味受體介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺神經(jīng)元的專一性結(jié)合是昆蟲嗅覺信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要生理學(xué)基礎(chǔ)。每個昆蟲嗅覺神經(jīng)元通常表達(dá)兩種氣味受體:傳統(tǒng)氣味受體和嗅覺共同受體Orco（之前被稱為Or83b）。每種昆蟲只有一種Orco受體基因，且都為果蠅Orco的直系同源基因(ortholog)

2、。各種昆蟲的Orco組成了Orco受體家族（Orco family）。Orco通過異源二聚化與傳統(tǒng)氣味受體形成一個具有氣味識別能力的復(fù)合體。Orco受體的主要功能是將傳統(tǒng)氣味受體運送至嗅覺神經(jīng)元樹突膜的表面，同時維持嗅覺受體復(fù)合體的構(gòu)象穩(wěn)定。對該受體基因的突變可以導(dǎo)致昆蟲嗅覺功能的嚴(yán)重缺失。因此，有望以O(shè)rco受體作為潛在的分子靶標(biāo)設(shè)計和發(fā)展新的害蟲治理策略。
　　絲光綠蠅Lucilia sericata Meigen和大頭金蠅C

3、hrysomyamegacephala Fabricius，屬于雙翅目Diptera麗蠅科Calliphoridae，是兩種重要的醫(yī)學(xué)媒介昆蟲。成蟲能機械性傳播多種病原體，危害人類健康。幼蟲作為兼性體外寄生蟲可以引起蠅蛆病，對畜牧業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。對于麗蠅嗅覺系統(tǒng)的研究先前主要集中在形態(tài)學(xué)、電生理學(xué)、行為學(xué)和化學(xué)生態(tài)學(xué)等方面，尚未開展有關(guān)嗅覺分子機制的研究。
　　目的
　　探究麗蠅嗅覺識別的分子基礎(chǔ)，克隆氣味受體基因并鑒

4、定其功能，為更有效的利用嗅覺系統(tǒng)進(jìn)行麗蠅綜合治理提供理論依據(jù)和實踐指導(dǎo)。
　　方法
　　1.采用RT-PCR方法和RACE策略克隆絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因的全長序列。利用多種生物信息學(xué)軟件分析新獲得基因的核酸序列，預(yù)測其推導(dǎo)氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征。
　　2.使用半定量RT-PCR方法檢測絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因在成蟲觸角、下顎須、胸部、腹部、足部及產(chǎn)卵器中的表達(dá)情況。
　　3.應(yīng)用原位雜交技術(shù)檢測大頭金

5、蠅Orco基因的mRNA在觸角和下顎須中的分布情況。
　　4.采用熒光定量PCR方法檢測絲光綠蠅Orco基因在卵、幼蟲、蛹及成蟲四個發(fā)育階段的相對表達(dá)水平。
　　5.為鑒定麗蠅Orco基因的功能，利用RNA干擾技術(shù)沉默大頭金蠅Orco基因的表達(dá)，通過Y型嗅覺儀驗證大頭金蠅對食物氣味趨化性行為反應(yīng)。
　　結(jié)果
　　1.克隆得到絲光綠蠅和大頭金蠅Orco基因的全長序列，分別命名為LserOrco（GenBank登錄號

6、:HQ315862）和CmegOrco（GenBank登錄號:HQ315861）。LserOrco和CmegOrco的開放讀碼框都為1437bp，編碼478個氨基酸殘基。兩條基因推導(dǎo)的蛋白序列不僅彼此間具有98％的同一性，并且與先前報道的其他昆蟲的同源受體之間具有高度的序列保守性。組成蛋白C末端的164個氨基酸為序列的極端保守區(qū)，氨基酸的同一性接近90％。LserOrco和CmegOrco的蛋白序列被預(yù)測都包含7個跨膜區(qū)，膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其

7、他昆蟲Orco蛋白相同，跨膜方式為受體蛋白的N末端位于膜內(nèi)C末端位于膜外。
　　2.LserOrco和CmegOrco在雌性和雄性的觸角及下顎須中呈強表達(dá)，在雌性的產(chǎn)卵器中存在微弱表達(dá);在其他非嗅覺組織中表達(dá)模式有所差別，LserOrco在雌性和雄性的足部有少量表達(dá)，在胸部和腹部無表達(dá)，而CmegOrco在雌性和雄性的腹部有少量表達(dá)，在胸部和足部無表達(dá)。
　　3.CmegOrco基因的mRNA在雌性和雄性的大部分嗅覺神經(jīng)元中

8、都有表達(dá)。在觸角第3節(jié)（鞭節(jié)）和下顎須的末端膨大處被探針標(biāo)記的陽性嗅覺神經(jīng)元呈廣泛性分布，而在觸角第1節(jié)（柄節(jié)）呈零星分布。
　　4.LserOrco在卵、幼蟲及成蟲三個階段都有表達(dá)，而在蛹的早期（蛹?xì)ば纬珊?6 hr左右）未見到表達(dá)。卵期相對表達(dá)量最低。在幼蟲期，LserOrco的相對表達(dá)量從1齡期到2齡期逐漸增加，到3齡期開始下降。LserOrco在成蟲嗅覺組織的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于卵和幼蟲階段的組織。其中，LserOrco在雌蠅

9、觸角中的相對表達(dá)量是卵的413倍。
　　5.對CmegOrco基因?qū)嵤㏑NA干擾后的24 hr、48 hr和72 hr，使用RT-PCR對dsRNA注射組、無RNase水注射組與未注射組CmegOrco基因的mRNA進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，與無RNase水注射組和未注射組相比，dsRNA注射組CmegOrco基因的表達(dá)量在48 hr和72 hr明顯降低，說明隨著時間增加，dsRNA對嗅覺器官中CmegOrco基因的表達(dá)起到了明顯的抑制

10、作用。無RNase水注射組與未注射組CmegOrco轉(zhuǎn)錄本的條帶強度十分接近，說明無RNase水對CmegOrco基因表達(dá)沒有影響。行為學(xué)實驗顯示，在假設(shè)大頭金蠅對食物源和對照品的選擇率相等（即H0）的前提下，未注射組（野生型）成蟲被腐敗豬肝產(chǎn)生的氣味強烈吸引(x2=16.634，df=1，p=0.000);同樣，注射無RNase水的成蟲對腐敗豬肝產(chǎn)生的氣味具有顯著的趨向性(x2=12.281，df=1，p=0.000)。然而，注射ds

11、RNA的成蟲對食物氣味的敏感性明顯減弱，在腐敗豬肝與對照品的選擇上呈隨機分布(x2=0.048，df=1，p=0.827)，接受Ho，表明dsRNA沉默了CmegOrco基因的表達(dá)，從而顯著損害了大頭金蠅的嗅覺能力。
　　結(jié)論
　　1.首次從兩種媒介昆蟲絲光綠蠅和大頭金蠅中克隆出氣味受體基因。
　　2.LserOrco和CmegOrco是果蠅Orco的直系同源基因，與Orco家族中的其他成員具有極為相似的結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)