花生ABA途徑抗逆基因AhLOS5克隆與抗逆性研究.pdf

1、花生（Arachis hypogaea L.）是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，以其扎根深、開花量大、花期長、無明顯的需水臨界期以及水分利用率較高等特點(diǎn)，具有較強(qiáng)的抗旱性，是發(fā)展旱作農(nóng)業(yè)和旱薄地開發(fā)的理想作物。干旱往往伴隨土壤荒漠化、鹽漬化的加重，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來多種因素的制約。在全球范圍內(nèi)，有2/3的花生分布在旱作地區(qū)，缺少灌溉條件加之瘠薄的砂質(zhì)土壤，使干旱和高鹽危害非常普遍，已成為花生生產(chǎn)上分布最廣、危害程度最大的限制因素。在我國，常年

2、有70％的花生遭受不同程度的干旱和高鹽脅迫，干旱和高鹽引起的莢果減產(chǎn)率平均在20%以上。
　　植物對(duì)非生物逆境的響應(yīng)伴隨著對(duì)生長發(fā)育過程很多基因的調(diào)控。植物激素脫落酸（abscisic acid, ABA）能參與植物對(duì)許多環(huán)境脅迫如干旱、冷害、鹽害等的生理反應(yīng)和分子生物學(xué)效應(yīng)。目前ABA已經(jīng)公認(rèn)為能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)不良環(huán)境的抗性（抗旱性、抗寒性、抗病性、耐鹽性等），是植物的“抗逆誘導(dǎo)因子”。目前公認(rèn)的高等植物體內(nèi)的ABA的生物合成

3、主要為間接途徑，反應(yīng)過程中的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（ZEP）、9-順式環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶（NCED）、ABA醛氧化酶（AAO）及鉬輔因子硫化酶（MCSU）是關(guān)鍵調(diào)控酶。
　　本研究從花生栽培品種‘豐花1號(hào)’中克隆了鉬輔因子硫酸化酶基因AhLOS5，進(jìn)行了抗逆性鑒定和基因功能驗(yàn)證。構(gòu)建了含AhLOS5基因的正義和反義植物表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化三生煙草，獲得了不同AhLOS5表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因煙草植株，并對(duì)這些轉(zhuǎn)基因株系的 T1代植

4、株進(jìn)行了生物學(xué)功能分析。通過生理分析、遺傳鑒定、分子生物學(xué)和生物化學(xué)的研究確定AhLOS5應(yīng)答非生物逆境的機(jī)制。具體結(jié)果如下：
　?。?）選取了黃淮?；ㄉa(chǎn)區(qū)4個(gè)主推品種，進(jìn)行抗旱性鑒定?？购敌阅芘琶麨椤ㄓ?0號(hào)’>‘豐花1號(hào)’>‘海花1號(hào)’>‘白沙1016’。
　?。?）在黃淮海花生主產(chǎn)區(qū)種植面積較大，同時(shí)表現(xiàn)高抗旱性的花生品種‘豐花1號(hào)’中成功克隆花生AhLOS5基因。全長2731個(gè)堿基，包括2451bp的開放閱讀框，

5、115bp的5′非編碼區(qū)，165bp的3′非編碼區(qū)，ORF編碼816個(gè)氨基酸。該基因編碼鉬輔因子硫酸化酶，屬于MOSC超家族。同源性分析證明，我們克隆得到的‘豐花1號(hào)’AhLOS5與花生二倍體野生種 A.duranensis中的 AdLOS5同源性最高，達(dá)到94.7%，與 AiLOS5同源性為92.2%。與其他高等植物相比，AhLOS5與同屬豆科的狹葉羽扇豆、矮沙冬青、木豆、同源性較高，分別為77.7%、73.7%和72.9%，與屬十字

6、花科的擬南芥同源性略低，為59.9%。
　?。?）以AhLOS5 cDNA核苷酸片段制備探針對(duì)4個(gè)主推品種中AhLOS5的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，AhLOS5在4個(gè)主推品種中表達(dá)量順序?yàn)椤ㄓ?0號(hào)’>‘豐花1號(hào)’>‘海花1號(hào)’>‘白沙1016’。我們發(fā)現(xiàn)，4個(gè)品種間的AhLOS5基因表達(dá)量排序與其抗旱性排序一致。驗(yàn)證了該基因在花生中的抗旱性。
　?。?）采用Northern雜交的方法對(duì)‘豐花1號(hào)’中AhLOS5的表達(dá)

7、特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，AhLOS5在花生中組成型表達(dá)，花生各器官中表達(dá)量順序?yàn)榛?成熟葉>幼果>果針>根>莖，在葉片中的表達(dá)量隨著葉齡的增加而增加，在葉片展開第50d達(dá)到峰值。AhLOS5的表達(dá)還受干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)，誘導(dǎo)作用明顯。
　?。?）構(gòu)建了2種植物表達(dá)載體，即含正義 AhLOS5的載體 pBI-LOS5和含反義AhLOS5的載體pBI-R-LOS5。以三生煙草為轉(zhuǎn)化受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將上述2種載體分別轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)

8、不同載體的轉(zhuǎn)基因煙草當(dāng)代（T0代）所結(jié)的種子，經(jīng)卡那霉素篩選，并結(jié)合轉(zhuǎn)基因株系的T1代植株P(guān)CR鑒定結(jié)果，初步確定，含反義AhLOS5的轉(zhuǎn)基因植株有20株，含正義AhLOS5的轉(zhuǎn)基因植株有52株，并選取部分不同類型的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了Northern雜交分析。
　　（6）通過轉(zhuǎn)基因煙草植株種子根長、葉綠素含量、相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）、抗壞血酸（ASA）、抗氧化酶活性（SOD，POD，CAT，APX）、內(nèi)源ABA、脯

9、氨酸等生理生化指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在干旱和鹽脅迫下，過表達(dá)AhLOS5的轉(zhuǎn)基因煙草轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)內(nèi)源ABA含量顯著升高，抗氧化酶活性明顯升高，膜脂完整性好，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量高。過表達(dá)AhLOS5能夠明顯的提高轉(zhuǎn)基因株系對(duì)干旱和鹽脅迫的抗性。
　?。?）用Northern blot方法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中另外3個(gè)抗逆相關(guān)基因DREB2B，RD22， P5CS表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在干旱和鹽脅迫下，正義轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照植株的3個(gè)基因 DREB