光學核酸分子探針信號放大策略用于生化分析的研究.pdf

1、核酸分子探針是具有廣泛用途的一類生化分析工具。典型的核酸分子探針由核酸分子序列和信號報告基團組成，通過堿基互補配對、親疏水作用、靜電吸附等非共價作用實現(xiàn)對目標物的識別，并通過光、電、磁等信號來報告探針與目標物的識別事件。在不同信號模式的核酸分子探針中，光學核酸分子探針因其靈敏度高、檢測對象廣、檢測手段豐富、不需要復雜儀器，甚至僅憑肉眼就可識別等特點，得到了科研工作者的廣泛青睞和深入研究。然而一般來說，目標物對核酸分子探針的信號觸發(fā)是按照

2、1:1的方式進行的，即一個目標物只能夠引發(fā)一個核酸分子探針的報告信號，這種方式限制了光學核酸分子探針對目標物的檢測靈敏度。為此，科研工作者們發(fā)展了各式各樣的信號放大方法，如核酸工具酶輔助的信號放大技術、基于核酸雜交的信號放大技術、基于納米材料的信號放大技術、基于熒光共軛聚合物的信號放大技術等。本論文以光學核酸分子探針為工具，以DNA和酶為檢測目標，發(fā)展了一些新的信號放大技術，具體開展了以下五個方面的工作：
　　1．考察了環(huán)氧氯丙烷

3、交聯(lián)的β-環(huán)糊精聚合物對標芘核酸分子探針的熒光增強能力，發(fā)展了一種新的信號放大策略，實現(xiàn)了對DNA的檢測。標記在核酸分子探針上的芘很容易進入β-環(huán)糊精的疏水空腔內，而芘對微環(huán)境的改變非常敏感，在疏水環(huán)境下發(fā)射出強烈的熒光。隨著互補序列的加入，探針與互補序列雜交形成雙鏈結構，使標記在堿基上的芘因為空間位阻離開疏水腔體，引起熒光的熄滅?；谶@樣的原理，本論文構建了一個“turn off”的DNA熒光檢測方法，線性檢測范圍為5.0～30 nm

4、ol/L，檢測限為3.0 nmol/L。為了進一步提高該方法的靈敏度，通過引入核酸外切酶I，把標芘核酸分子探針水解為單核苷酸，降低了芘與環(huán)糊精腔體主客體識別的空間位阻，提高了芘與β-環(huán)糊精聚合物主客體結合能力，使得芘的熒光進一步增強，可將檢測限降低到0.9 nmol/L。
　　2．合成了一種新的陽離子β-環(huán)糊精聚合物，并基于此聚合物對單標記芘的核酸分子探針的熒光增強作用發(fā)展了一種熒光方法用于DNA、腺苷和汞離子的檢測。這種陽離子β

5、-環(huán)糊精聚合物表面帶有氨基，在中性pH水溶液中帶正電荷。由于聚合物表面帶有正電荷，可以通過靜電吸附作用與標記了芘的核酸分子探針結合，有利于芘進入環(huán)糊精疏水腔體內，發(fā)出強烈的熒光。隨著互補序列的加入，核酸分子探針與互補序列雜交形成雙鏈結構，使芘因為空間位阻離開疏水腔體，引起熒光的熄滅。相比于上一個工作，這種核酸分子探針只需要標記一個芘，無需引入酶即可實現(xiàn)對DNA的靈敏檢測，線性檢測范圍為1.25～5.0 nmol/L，檢測限為0.3 nm

6、ol/L，也表現(xiàn)出良好的選擇性，并可用于腺苷和汞離子的檢測。
　　3．基于納米金顆粒比色法和核酸雜交鏈式放大（HCR）技術發(fā)展了一種高靈敏檢測DNA的方法。當目標DNA不存在時，兩段發(fā)夾狀輔助探針 H1/H2在溶液中可以穩(wěn)定共存，并且由于發(fā)夾探針有一段6 nt的凸出末端能夠穩(wěn)定納米金顆粒，可以有效避免高鹽溶液引起的納米金顆粒團聚。當目標DNA存在時，目標DNA可以與輔助探針H1/H2雜交引發(fā)HCR反應，形成一段雙鏈的長鏈結構。而這

7、種 DNA長鏈結構因為沒有凸出末端，不能起到保護納米金顆粒的作用，當加入高濃度的鹽時，納米金顆粒就會發(fā)生團聚，然后納米金顆粒溶液顏色就會出現(xiàn)從紅到藍的變化。這個檢測方法簡便易行，不需要酶的參與，也不需要分離洗脫、化學修飾和昂貴儀器。本工作結合HCR這種無酶的信號放大技術對納米金顆粒比色法進行了有效的改進，解決了傳統(tǒng)納米金顆粒比色法靈敏度差的缺點，裸眼比色的檢測限為100 pmol/L，用紫外可見分光光度計檢測的檢測限為50 pmol/L

8、，相比于傳統(tǒng)納米金顆粒比色法檢測限降低了兩個數(shù)量級，而且對單堿基突變的DNA鏈也表現(xiàn)出較好的選擇性。
　　4．基于限制性內切酶和滾環(huán)擴增技術發(fā)展了一種可以對DNA甲基化酶活性進行靈敏檢測的熒光方法。當有Dam甲基化酶存在時，發(fā)夾探針甲基化酶識別位點上的腺嘌呤被甲基化，同時被限制性內切酶Dpn I識別酶切。酶切產(chǎn)物可以作為引物與DNA模板結合觸發(fā)滾環(huán)擴增反應。每個滾環(huán)擴增反應的產(chǎn)物都有數(shù)千個可以和大量分子信標雜交的重復單元，實現(xiàn)對信

9、號的放大。當沒有Dam甲基化酶時，甲基化/酶切反應和滾環(huán)擴增放大反應都不會啟動，也沒有熒光信號的變化。該方法對甲基化酶的線性檢測范圍為0.5?30 U/mL，檢測限可以達到0.18 U/mL。該方法還可以應用于評價甲基化轉移酶的抑制劑，有望在藥物研發(fā)中得到應用。
　　5．基于分子信標發(fā)展了一種谷丙轉氨酶活性的高靈敏檢測方法。谷丙轉氨酶能夠催化轉氨基反應，即將氨基從丙氨酸轉移到α-酮戊二酸上。這個轉氨基反應的產(chǎn)物為丙酮酸和谷氨酸。在