肽核酸和“RecA蛋白—互補(bǔ)單鏈DNA探針”生物信號(hào)放大系統(tǒng)用于壓電基因傳感器的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以肽核酸探針及“RecA蛋白-互補(bǔ)單鏈DNA探針”生物信號(hào)放大系統(tǒng)提高石英諧振式基因傳感器陣列檢測系統(tǒng)的靈敏度，并探索對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行直接檢測的可行性。 方法：1.利用精細(xì)微加工法制作單個(gè)石英諧振式傳感器，并在其兩面光刻出金膜電極，比較了不同電極厚度及直徑對(duì)基因雜交檢測的影響。在此基礎(chǔ)上先后構(gòu)建了拔插式2×5型傳感器陣列。并自行開發(fā)研制自激式振蕩電路、PESAV2.0版頻率記錄分析軟件，將它們與計(jì)算機(jī)聯(lián)用以構(gòu)建石英諧振式基因

2、傳感器陣列檢測系統(tǒng)。 2.探討用PNA作為探針與普通的DNA探針相比對(duì)壓電傳感器基因雜交的優(yōu)越性。用生物素-親和素法分別將PNA,DNA兩種探針固定在基因傳感器的金膜表面，分別與完全匹配、一個(gè)堿基錯(cuò)配、兩個(gè)堿基錯(cuò)配的互補(bǔ)靶序列進(jìn)行雜交，觀察兩種不同的探針與靶序列反應(yīng)所引起的頻率變化及所用的時(shí)間。 3.在傳感器陣列表面固定上HBV的bis-PNA探針，利用“RecA蛋白-互補(bǔ)單鏈DNA探針”與固定的肽核酸(bis-PNA)

3、探針相結(jié)合，摸索最適的液相反應(yīng)條件，以提高壓電基因傳感器表面的質(zhì)量負(fù)載，從而提高檢測的靈敏度。 4.實(shí)驗(yàn)后期還探索了利用bis-PNA探針對(duì)36例臨床大三陽標(biāo)本和14例陰性血清中抽提的基因組DNA直接進(jìn)行檢測的可行性，并比較了加入“RecA蛋白-互補(bǔ)單鏈DNA探針”較未加此反應(yīng)體系時(shí)，所引起的質(zhì)量-頻率效應(yīng)明顯。 結(jié)果：1.選擇了更有利于傳感器在液相中穩(wěn)定的AT切型石英晶體作為傳感器基片，金膜電極厚度在50nm-100n

4、m的范圍內(nèi)最適合于用作基因雜交的檢測，電極直徑4.0mm時(shí)插損較小，對(duì)質(zhì)量負(fù)載承受能力強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的拔插式傳感器陣列具有方便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)。 2.自行研制的自激式振蕩電路有非常強(qiáng)的振蕩能力，在液相中起振非常容易，其頻率穩(wěn)定度也可達(dá)實(shí)用要求，同時(shí)拔插式傳感器可有效提高傳感器在液相中頻率穩(wěn)定的程度，氣、液相頻率均可達(dá)±1Hz，進(jìn)一步優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件。 3.自行開發(fā)的PESAV2.0版頻率記錄分析軟件具有自行設(shè)置各初始

5、參數(shù)，實(shí)時(shí)記錄頻率變化、自動(dòng)繪制頻率變化趨勢圖及分析結(jié)果等多項(xiàng)功能，采集、分析后的數(shù)據(jù)自動(dòng)輸入到計(jì)算機(jī)。 4.相對(duì)于DNA探針，PNA探針識(shí)別堿基錯(cuò)配的能力明顯提高，且雜交時(shí)間更短。PNA探針與靶序列DNA結(jié)合有高度的特異性，選用PNA作探針，可提高壓電基因傳感器檢測的特異性。 5.1觀察當(dāng)RecA蛋白濃度為0.5、0.85、1.5、3、4.5、6mg/ml時(shí)的反效果。結(jié)果表明，當(dāng)濃度為0.5～3mg/ml時(shí)，所引起的頻

6、率下降值依次升高，隨后又出現(xiàn)了降低，當(dāng)濃度為3mg/ml時(shí)，反應(yīng)效果最顯著。 5.2當(dāng)RecA蛋白濃度為3mg/ml時(shí)，不同濃度的ATPγS與其結(jié)合所引起的頻率下降值不同，ATPγS濃度從5μM變化至12.5μM，所引起的頻率下降依次升高，當(dāng)濃度為12.5μM，頻率下降值最大，隨后隨著濃度的升高，頻率出現(xiàn)了下降的趨勢。 6.加入“RecA蛋白-互補(bǔ)單鏈DNA探針”后，質(zhì)量-頻率效應(yīng)明顯，提高了反應(yīng)的靈敏度。 結(jié)論

7、：1.AT切型、基頻10MHz的石英晶體，金膜電極直徑4.0mm，厚度在50nm-100nm的范圍內(nèi)最適合用于壓電石英晶體基因傳感器。 2.自激式振蕩電路對(duì)石英諧振式基因傳感器陣列的液相振蕩進(jìn)行了特別的優(yōu)化，使傳感器陣列能夠在液相中更穩(wěn)定地工作。 3.“PESAV2.0”應(yīng)用軟件是一類可實(shí)時(shí)記錄與分析石英晶體諧振頻率的新型實(shí)用性軟件。 4.新型可調(diào)拔插式傳感器檢測池可有效地提高傳感器在液相中頻率穩(wěn)定程度。

8、 5.與普通的DNA探針相比，PNA與核酸序列的結(jié)合有著極高的特異性，PNA能夠區(qū)分正確配對(duì)及錯(cuò)配的序列，PNA對(duì)互補(bǔ)DNA的錯(cuò)配容忍程度也比相應(yīng)的DNA/DNA更低，由于PNA對(duì)堿基錯(cuò)配的識(shí)別能力強(qiáng)，用PNA作探針可大大提高反應(yīng)的特異性。 6.以設(shè)計(jì)的bis-PNA探針實(shí)現(xiàn)了對(duì)臨床標(biāo)本中HBV基因組DNA的直接檢測，而且標(biāo)本DNA的濃度范圍正好在傳感器檢測的線性范圍之內(nèi)。因此，石英諧振式傳感器陣列檢測系統(tǒng)的成功構(gòu)建為定量檢測臨