蛋白質(zhì)的定量分析新方法及其與小分子化合物的相互作用研究.pdf

1、蛋白質(zhì)是生命科學(xué)的重要研究對(duì)象之一，其中人血清白蛋白(HSA)是人體內(nèi)含量最豐富的運(yùn)輸?shù)鞍住SA有許多重要的生理學(xué)和藥理學(xué)功能，能與許多內(nèi)源和外源性物質(zhì)如脂肪酸、氨基酸、荷爾蒙、陰陽(yáng)離子和藥物等結(jié)合，起到存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)作用。人免疫球蛋白(γ-G)作為淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表面受體在許多細(xì)胞活動(dòng)中扮演著重要角色，同時(shí)在人體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。因此，HSA和Y-G已成為研究最廣泛的目標(biāo)蛋白。發(fā)展高靈敏度、高選擇性的蛋白質(zhì)定量分析新方法以及

2、研究毒性物質(zhì)、藥物等小分子配體與蛋白質(zhì)的相互作用機(jī)理和作用過(guò)程，在生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)及藥代動(dòng)力學(xué)上具有重要意義，該領(lǐng)域已成為從事生命科學(xué)、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等學(xué)科研究的科研工作者共同關(guān)注的課題之一。本論文基于研究蛋白質(zhì)的定量分析新方法及小分子與蛋白質(zhì)相互作用的重要意義及國(guó)內(nèi)外研究趨勢(shì)，在總結(jié)前人工作的基礎(chǔ)上，綜合利用共振光散射光譜、熒光光譜、紫外．可見吸收光譜、傅里葉變換紅外光譜、圓二色性光譜、計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)和動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)，

3、從以下幾方面進(jìn)行了創(chuàng)新性研究： 1、將自行組裝的全內(nèi)反射及流動(dòng)注射裝置與熒光光譜儀聯(lián)用，建立了測(cè)定人血清樣品中蛋白質(zhì)含量的新方法，獲得了與蘭州大學(xué)第一醫(yī)院一致的結(jié)果。 2、研究了偶氮胂-TB、鈣試劑兩種染料和中藥活性組分大豆甙元與蛋白質(zhì)的相互作用及結(jié)合機(jī)理，根據(jù)Scatchard方程和Stern-volmer方程計(jì)算了反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，進(jìn)而根據(jù)van’t Hoff方程求得反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，討論了上述有機(jī)小分子與

4、蛋白質(zhì)的主要作用力類型。 3、利用傅立葉變換紅外光譜技術(shù)和圓二色性光譜技術(shù)考察了蛋白質(zhì)與有機(jī)小分子作用前后其二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，并且采用計(jì)算機(jī)分子對(duì)接模擬技術(shù)研究了染料與人血清白蛋白的鍵合，提出了染料與人血清白蛋白相互作用的分子模型，獲得與實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果。 4、研究了人免疫球蛋白在油包水型微乳液中與藥物大豆甙元的相互作用，并且與在水溶液中的相互作用進(jìn)行了比較，同時(shí)利用熒光偏振技術(shù)和動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)研究了微乳液水池大小對(duì)人免疫

5、球蛋白和大豆甙元相互作用的影響。論文共分為七章：第一章：簡(jiǎn)要介紹了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和性質(zhì)；綜述了蛋白質(zhì)的定量分析方法及有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)相互作用的研究?jī)?nèi)容和研究方法。 第二章：基于測(cè)定水/四氯化碳(H<,2>O/CCl<,4>)界面的全內(nèi)反射共振光散射(TIR-RLS)強(qiáng)度，建立了人血清樣品中蛋白質(zhì)的定量分析新方法。在pH 4.10且有十六烷基溴化鈉(CTAB)存在的條件下，偶氮胂-TB與人血清白蛋白(HSA)的相互作用可導(dǎo)致

6、體系的TIR-RLS信號(hào)增強(qiáng)，最大散射峰位于330 nm處，增強(qiáng)的TIR-RLS強(qiáng)度與}tSA濃度在0.5-42.3 μg/mL范圍內(nèi)成正比，檢測(cè)限(3σ)為198ng/mL。該方法已用于6個(gè)人血清樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，其最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2％，回收率在97-103％之間。 第三章：基于在pH 4.1的酸性條件下，蛋白質(zhì)對(duì)甲基藍(lán)(MB)的共振光散射(RLS)信號(hào)有強(qiáng)烈增強(qiáng)作用的現(xiàn)象，建立了測(cè)定蛋白質(zhì)的流動(dòng)注射．共振光散射新

7、方法。在333 nm處增強(qiáng)的RLS強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比。該體系中人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的線性范圍分別為2.0-37.3μg/mL和1.0-36.0μg/mL，檢測(cè)限(3σ)分別為45 ng/mL和80 ng/mL。該方法已成功地用于5個(gè)人血清樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，其最大相對(duì)誤差不超過(guò)為1％，回收率在98-102％之間，進(jìn)樣率為60 h<'-1>。 第四章：基于在pH 4.1的酸性溶液中，蛋白質(zhì)對(duì)酸性鉻

8、蘭K(ACBK)的共振光散射(RLS)信號(hào)有強(qiáng)烈增強(qiáng)作用的現(xiàn)象，建立了測(cè)定人血清樣品中蛋白質(zhì)含量的流動(dòng)注射-共振光散射新方法。在264 nm處增強(qiáng)的RLS強(qiáng)度分別與人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)的濃度在2.0-40.0μg/mL和4.0-33.8μg/mL范圍內(nèi)成正比，檢測(cè)限(3σ)分別為85 ng/mL和124 ng/mL。該方法已成功地用于6個(gè)人血清樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，其最大相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)為2％，回收率在97

9、-103％之間，進(jìn)樣率為60 h<'-1>。 第五章：利用共振光散射技術(shù)、傅立葉變換紅外光譜法和圓二色性光譜法研究了染料偶氮胂-TB(ATB)與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，計(jì)算了不同溫度下ATB與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了ATB與HSA之間的作用力類型，并定量分析了ATB與HSA的相互作用對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果表明，結(jié)合常數(shù)及最大結(jié)合位點(diǎn)數(shù)隨著溫度的升高而降低

10、。由熱力學(xué)數(shù)據(jù)可知，ATB與HSA之間的結(jié)合是自發(fā)的、放熱的過(guò)程，并且以疏水作用為主；ATB的結(jié)合能使HSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β結(jié)構(gòu)增加。 第六章：利用共振光散射技術(shù)、傅立葉變換紅外光譜法、圓二色性光譜法和分子模擬技術(shù)研究了染料鈣試劑與人血清白蛋白(HSA)之間的相互作用。光譜數(shù)據(jù)表明，鈣試劑與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)及最大結(jié)合位點(diǎn)數(shù)隨著溫度的升高而降低。由熱力學(xué)數(shù)據(jù)可知，鈣試劑與HSA之間的結(jié)合是自發(fā)的、放熱的過(guò)程，并且以疏

11、水作用為主。對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究表明，鈣試劑的結(jié)合能使HSA的α-螺旋及β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)減少、β-折疊結(jié)構(gòu)增加。分子模擬結(jié)果顯示鈣試劑結(jié)合在HSA的ⅡA子域內(nèi)。 第七章：利用熒光光譜法、紫外?？梢娢展庾V法、圓二色性光譜法和動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)研究了模擬生理?xiàng)l件下在水/AOT/異辛烷的反相微乳介質(zhì)中大豆甙元與人免疫球蛋白(γ-G)之間的相互作用。光譜數(shù)據(jù)表明，大豆甙元通過(guò)靜態(tài)機(jī)理猝滅γ-G的內(nèi)在熒光，以單一結(jié)合部位與γ-G相互作用，其