基于異喹啉類生物堿小分子與AP-DNA相互作用的DNA識(shí)別.pdf

1、細(xì)胞的功能主要依靠基因組的精確度，這種精確度受到DNA各種缺失的威脅。由體內(nèi)糖苷酶剪切DNA分子中損傷堿基的過(guò)程中產(chǎn)生的脫嘌呤或脫嘧啶位點(diǎn)，統(tǒng)稱為脫堿基位點(diǎn)(AP位點(diǎn))，它是一種常見(jiàn)的DNA變異和致癌的損傷DNA缺失。這種由堿基缺失所引起DNA序列多態(tài)性與人類各種各樣的疾病密切相關(guān)，近幾年來(lái)，利用小分子檢測(cè)核苷堿基以及AP位點(diǎn)的DNA檢測(cè)受到廣泛關(guān)注，這種方法不僅有助于從分子水平上理解藥物的抗癌機(jī)制而且為功能性傳感器的設(shè)計(jì)提供了新的思路

2、。然而，雖然人們對(duì)小分子識(shí)別AP位點(diǎn)或核苷堿基已經(jīng)做了大量的研究，但大多基于的是熒光猝滅機(jī)制，其高背景信號(hào)對(duì)DNA的檢測(cè)帶來(lái)諸多限制。基于此，本文建立了基于小分子與AP位點(diǎn)相互作用的熒光增強(qiáng)型、熒光背景低的DNA識(shí)別方法。本論文選用具有代表性的異喹啉生物堿小分子—小檗堿和血根堿作為熒光探針，通過(guò)小檗堿與AP-DNA(含AP位點(diǎn)的DNA)的強(qiáng)烈的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)了的熒光增強(qiáng)型伴隨熒光雙峰的多色性的核苷堿基的識(shí)別;基于與血根堿與AP-DNA的

3、相互作用實(shí)現(xiàn)了較大發(fā)射位移的AP位點(diǎn)的識(shí)別;最后發(fā)現(xiàn)小檗堿還可以應(yīng)用于檢測(cè)四連體DNA。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.采用小檗堿分子為熒光探針，借助DNA中AP位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，建立了DNA核苷堿基的識(shí)別方法。在一定的條件下，小檗堿強(qiáng)烈特異性與AP-DNA結(jié)合，本文利用紫外可見(jiàn)吸收光譜，熒光穩(wěn)態(tài)和熒光壽命，DNA熔點(diǎn)測(cè)定，熒光共振能量轉(zhuǎn)移等表征方法對(duì)小檗堿強(qiáng)與AP-DNA結(jié)合的特異性進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:弱熒光性的小檗堿易與AP位點(diǎn)強(qiáng)

4、烈結(jié)合，熒光顯著增強(qiáng).且其熒光性質(zhì)隨脫堿基位點(diǎn)對(duì)面堿基及側(cè)翼堿基的不同而不同,當(dāng)側(cè)靶標(biāo)堿基為嘧啶時(shí)，小檗堿的熒光出現(xiàn)雙峰;而當(dāng)靶標(biāo)堿基為嘌呤時(shí)，只出現(xiàn)單峰。本文就雙峰出現(xiàn)的機(jī)理也進(jìn)行了一定的探討。這一工作實(shí)現(xiàn)了熒光增強(qiáng)型的具有發(fā)射雙峰DNA堿基的識(shí)別。與之前的檢測(cè)方法相比，此方法的優(yōu)越性在于實(shí)現(xiàn)了熒光增強(qiáng)型的多色的堿基識(shí)別，為核苷酸堿基的識(shí)別提供了一種更簡(jiǎn)便、快速、有效的方法。
　　2.選用血根堿為熒光探針，在DNA中設(shè)置AP位點(diǎn)

5、，基于血根堿與AP位點(diǎn)的特異性結(jié)合，建立了熒光選擇性增強(qiáng)同時(shí)發(fā)射位置出現(xiàn)較大變化的識(shí)別AP位點(diǎn)的熒光方法。在水溶液中，血根堿溶液中存在著季銨鹽形式（離子型）和非離子形式（不帶電荷）兩種結(jié)構(gòu)的平衡，這種平衡與pH有關(guān)，在一定條件下，兩種結(jié)構(gòu)可以相互轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):在PH為8.3的條件下，當(dāng)有AP位點(diǎn)存在時(shí)，非離子型的血根堿轉(zhuǎn)化成離子型結(jié)構(gòu)，發(fā)射出現(xiàn)多達(dá)170nm的移動(dòng)，且血根堿的離子型熒光會(huì)隨著AP位點(diǎn)對(duì)面堿基不同有不同程度增強(qiáng)。而當(dāng)靶標(biāo)

6、DNA不含AP位點(diǎn)即FM-DNAs，發(fā)射峰移動(dòng)不明顯，熒光發(fā)生猝滅。本章通過(guò)紫外可見(jiàn)吸收光譜、穩(wěn)態(tài)熒光、熒光壽命、DNA熔點(diǎn)測(cè)定等表征分析方法研究了血根堿與AP-DNAs，F(xiàn)M-DNAs相互作用的熒光特性，同時(shí)對(duì)其機(jī)理進(jìn)行了探討。本實(shí)驗(yàn)基于血根堿與AP位點(diǎn)的特異性結(jié)合，導(dǎo)致其非離子型轉(zhuǎn)化為離子型結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)了伴隨著較大的發(fā)射位移實(shí)現(xiàn)AP位點(diǎn)的檢測(cè)。
　　3.惡性腫瘤嚴(yán)重的危害著人類健康和生命，近幾十年來(lái)，抗腫瘤新藥的研發(fā)已取得了

7、顯著成就，其中以G-四鏈體為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的研究引起了人們的密切關(guān)注。研究表明，誘導(dǎo)DNA形成G-四鏈體或者能與G-四鏈體結(jié)合并使之穩(wěn)定的化合物可抑制端粒酶活性或通過(guò)降低癌基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而具有抗腫瘤的作用，G-四鏈體逐漸成為一個(gè)極具潛力的抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn).G-四鏈體DNA中脫G堿基的存在，明顯影響著G-四鏈體DNA的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性，而關(guān)于這方面的研究較少。本文考察了異喹啉類生物堿與不同G-四鏈體DNA相互作用，我們發(fā)現(xiàn)小檗堿分子能與c