抗獨(dú)特型納米抗體的親和力成熟及檢測伏馬菌素B1綠色免疫分析方法的研究.pdf

1、伏馬菌素（Fumonisin, FB）主要由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）等鐮刀菌屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，主要污染玉米及其制品。目前，已發(fā)現(xiàn)20多種伏馬菌素及其衍生物，其中FB1是最主要組分，其毒性也最強(qiáng)。檢測樣品中FB1的方法有理化分析法和免疫分析法，免疫分析法具有選擇性好、操作簡便、耗時短、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合于食品安全監(jiān)測時高通量快速篩檢。而FB1是小分

2、子化合物，一般采用競爭免疫分析模式進(jìn)行檢測；這種檢測模式需要FB1標(biāo)準(zhǔn)物和化學(xué)合成抗原，化學(xué)合成抗原時也需使用大量FB1標(biāo)準(zhǔn)物及有機(jī)溶劑；這些物質(zhì)的使用對操作人員的健康具有潛在的危害，若廢液處理不當(dāng)，還可能對實(shí)驗(yàn)室及環(huán)境造成污染。
　　本研究以antiFB1 mAb(3F11)為靶分子，從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫中淘選得到與antiFB1 mAb(3F11)特異結(jié)合的抗獨(dú)特型納米抗體，以該抗獨(dú)特型納米抗體作為FB1抗原模擬物，替

3、代傳統(tǒng)抗原，建立免疫分析方法提高檢測靈敏度。其次，將抗獨(dú)特型納米抗體與堿性磷酸酶融合表達(dá)，將融合蛋白作為酶標(biāo)抗原，分別建立了一步酶聯(lián)免疫分析和一步化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。最后，通過熱點(diǎn)隨機(jī)突變使抗獨(dú)特型納米抗體親和力得以提高，并將親和力提高的Ab2 Nb B1D作為標(biāo)準(zhǔn)物，建立了FB1綠色免疫分析方法。主要研究內(nèi)容如下：
　　1從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫中首次淘選得到抗FB1單抗的抗獨(dú)特型納米抗體，建立以抗獨(dú)特型納米抗體替代傳統(tǒng)抗

4、原的綠色免疫分析方法。
　　1.1基于抗獨(dú)特型納米抗體FB1模擬物的淘選
　　以antiFB1 mAb(3F11)為靶分子，經(jīng)過3輪親和淘選，從羊駝天然納米抗體噬菌體文庫中獲得一株可與antiFB1 mAb(3F11)特異性結(jié)合的抗獨(dú)特型納米抗體B26，建立了檢測FB1的間接競爭PhageELISA，該方法的IC50值為1.07±0.22 ng/mL。
　　1.2抗獨(dú)特型納米抗體的表達(dá)及其在免疫檢測中的應(yīng)用
　　

5、將B26的編碼基因克隆至pET25b表達(dá)載體，構(gòu)建原核表達(dá)載體pETB26,自誘導(dǎo)表達(dá)純化后得到可溶性的抗獨(dú)特型納米抗體，將其作為包被抗原建立NbELISA；該方法的IC50為0.95±0.12 ng/mL，線性范圍為0.27–5.92 ng/mL；靈敏度比傳統(tǒng)ELISA提高了20倍；與FB2的交叉反應(yīng)率為4.93％，與其它四種真菌毒素（DON、AFB1、OTA、ZEN）無交叉反應(yīng)；Ab2 Nb只選擇與antiFB1 mAb(3F11)

6、可變區(qū)發(fā)生特異性結(jié)合，其為半抗原抑制性獨(dú)特型抗體；對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率為71.90%112.15%之間；分別采用NbELISA與市售ELISA試劑盒對30份實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性為0.992。
　　1.3抗原抗體結(jié)合動力學(xué)參數(shù)的分析
　　采用生物薄膜光干涉技術(shù)分別對Ab2 Nb、FB1BSA與antiFB1 mAb(3F11)的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行測定；Ab2 Nb對antiFB1 mAb(3F1

7、1)的KD值為164.6 nM，F(xiàn)B1BSA對antiFB1 mAb(3F11)的KD值為0.62 nM。Ab2 Nb與antiFB1 mAb(3F11)具有較低的親和力，NbELISA顯示出比傳統(tǒng)ELISA更高的靈敏度。結(jié)果提示：在競爭免疫分析方法中，小分子化合物與包被抗原競爭能力起關(guān)鍵作用，適當(dāng)選用與抗體的親和力較低的包被抗原，有利提高檢測靈敏度。
　　2成功將抗獨(dú)特型納米抗體與堿性磷酸酶融合表達(dá)，首次制備了納米抗體類酶標(biāo)抗原

8、，建立檢測FB1的直接競爭一步法綠色免疫分析方法。
　　2.1直接競爭一步ELISA的建立
　　成功制備了抗獨(dú)特型納米抗體堿性磷酸酶融合蛋白（Ab2 NbAP），該融合蛋白仍保留了良好的堿性磷酸酶活性和抗體結(jié)合能力；以Ab2 NbAP為酶標(biāo)抗原，建立了檢測谷物中FB1的直接競爭一步ELISA；該方法的IC50為2.69±0.25 ng/mL，線性范圍為0.93–7.73 ng/mL，最低檢測限（LOD）為0.35 ng/mL

9、；批內(nèi)加標(biāo)回收率為81.50%112.24%、批內(nèi)變異系數(shù)為2.43%11.41%，批間加標(biāo)回收率為71.20%114.03%、批間變異系數(shù)為2.51%12.50%。
　　2.2直接競爭一步CLIA的建立
　　以Ab2 NbAP為酶標(biāo)抗原，建立了檢測谷物中FB1的直接競爭一步 CLIA；該方法的IC50為0.89±0.09 ng/mL，線性范圍分別為0.29–2.68 ng/mL，LOD為0.12 ng/mL，靈敏度比以FB

10、1BSA建立的兩步法ELISA提高了9倍；與FB2的交叉反應(yīng)率為4.93%，與其它四種真菌毒素（DON、AFB1、OTA、ZEN）無交叉反應(yīng)；批內(nèi)加標(biāo)回收率為85.40%112.68%、批內(nèi)變異系數(shù)為2.47%13.03%，批間加標(biāo)回收率為83.50%109.25%、批間變異系數(shù)為2.74%14.86%；實(shí)際谷物樣本的檢測結(jié)果與LCMS/MS的檢測結(jié)果相關(guān)系數(shù)為0.97。
　　3抗獨(dú)特型納米抗體體外親和力成熟
　　3.1熱點(diǎn)

11、隨機(jī)突變提高抗獨(dú)特型納米抗體親和力
　　對B26的CDR3區(qū)2處熱點(diǎn)涉及4位氨基酸進(jìn)行隨機(jī)突變，通過親和淘選獲得4株突變子；相比B26，4株突變子的顯色值明顯增強(qiáng)，提示其與antiFB1 mAb(3F11)的結(jié)合活性增強(qiáng)，靈敏度均降低；B1D、B2E、B3I和B4L與antiFB1 mAb(3F11)的KD值分別為10.4 nM、25 nM、49.5 nM和55 nM，提示4株突變子的親和力均得到提高，其中B1D與抗體的親和力較B

12、26提高15.8倍，進(jìn)一步證實(shí)：在競爭免疫分析方法中，檢測抗原與抗體的親和力提高了，其檢測靈敏度將低；相比B26和化學(xué)合成抗原，B1D、B2E、B3I和B4L的熱穩(wěn)定性均有明顯提高。
　　3.2基于抗獨(dú)特型納米抗體的綠色ELISA方法的建立。
　　分別建立以FB1標(biāo)準(zhǔn)物及Ab2 Nb B1D為標(biāo)準(zhǔn)物的間接競爭ELISA；在相同的抑制率下，Ab2 Nb B1D濃度與FB1標(biāo)準(zhǔn)物濃度具有良好的線性相關(guān)，方程為y=1.7x+3.2

13、(R2=0.998)，其中y為FB1濃度，x為Ab2 Nb B1D濃度；采用兩步法計(jì)算FB1含量，首先根據(jù)樣品檢測的抑制率計(jì)算替代標(biāo)準(zhǔn)物的Ab2 Nb B1D濃度，然后通過Ab2 Nb B1D濃度與FB1的線性相關(guān)方程，再轉(zhuǎn)換為樣品中FB1含量。進(jìn)行FB1的添加回收試驗(yàn)，批內(nèi)加標(biāo)回收率為75.60%112.12%、批內(nèi)變異系數(shù)為2.70%9.66%，批間加標(biāo)回收率為72.80%115.44%、批間變異系數(shù)為3.17%11.04%；分別采