微流控芯片上單細(xì)胞分析的研究.pdf

1、檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)化學(xué)組分，以及測(cè)定單細(xì)胞對(duì)外界刺激的成分變化，有助于理解基本細(xì)胞功能以及細(xì)胞內(nèi)外聯(lián)系，有助于檢測(cè)和鑒別大量細(xì)胞群體中少量的不正常細(xì)胞，因此單細(xì)胞的研究在重大疾病早期診斷、治療、藥物篩選和細(xì)胞生理、病理過(guò)程的研究方面有重要意義，已成為目前生命科學(xué)、生化分析等學(xué)科研究的熱門課題之一。 由于單細(xì)胞體積小，胞內(nèi)物質(zhì)濃度低，需要高靈敏度的檢測(cè)方法，如激光誘導(dǎo)熒光(LIF)法。但是大多數(shù)胞內(nèi)組分濃度低又無(wú)天然熒光，因此在解決微

2、衍生的問(wèn)題上還存有相當(dāng)?shù)目臻g。 最近，用微流控芯片技術(shù)對(duì)生物細(xì)胞的研究引起了廣泛注意，在近些年來(lái)得到快速發(fā)展。微流控芯片微米尺寸的通道適于單細(xì)胞引入，操縱，反應(yīng)，分離及檢測(cè)。 本論文首次用芯片毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光法定量測(cè)定了單個(gè)人血紅細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)，將細(xì)胞進(jìn)樣、單細(xì)胞定位、溶膜和毛細(xì)管電泳分離，集成到一塊玻璃微芯片完成。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)、過(guò)氧化氫等，它不但與衰老、動(dòng)脈硬化、

3、關(guān)節(jié)炎、細(xì)胞凋亡及癌變等密切相關(guān)，并且由于它易擴(kuò)散和降解，普遍存在于各類細(xì)胞中，它還起細(xì)胞間信使分子的作用。因此，細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定已受到普遍重視。我們用可透膜的雙氫羅丹明123(DHR123)作為衍生試劑，DHR123無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后，以細(xì)胞本身作為微反應(yīng)器，和細(xì)胞內(nèi)ROS反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物羅丹明123(Rh123)，通過(guò)微芯片電泳激光誘導(dǎo)熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Rh123，間接對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行了定量。我們討論了Rh123遷移時(shí)間隨pH的

4、變化，得到最佳檢測(cè)條件，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法，定量測(cè)定了單個(gè)人血紅細(xì)胞內(nèi)ROS。該法由于避免了制備細(xì)胞懸液時(shí)溶劑的稀釋作用，使分析靈敏度大大提高。方法檢測(cè)下限為0.74amol，每分鐘檢測(cè)兩個(gè)細(xì)胞，連續(xù)測(cè)定6個(gè)單細(xì)胞遷移時(shí)間的精密度為2.1％。為研究單細(xì)胞受外界刺激前后ROS的變化提供了方法和工具。 在微流控芯片單細(xì)胞分析中，細(xì)胞能夠進(jìn)入微通道是微流控芯片分析細(xì)胞的前提，但是，除了某些特定選擇的可以避免吸附的細(xì)胞，大部分細(xì)胞傾向于吸附

5、在細(xì)胞容器表面。人體腫瘤細(xì)胞在水溶液中貼壁、自聚集，以及因?yàn)橹亓σ鸬某练e成為芯片上單細(xì)胞操縱和分析的障礙。因此，本文用傳統(tǒng)的光刻法和三步刻蝕法研制了新型多深度微流控芯片。其中進(jìn)樣通道深37μm，分離通道深12μm，在分離通道中距離十字交叉口300μm處加工一個(gè)1mm長(zhǎng)的圍堰，該處只有6μm深。通過(guò)加寬加深微流控芯片的進(jìn)樣通道，結(jié)合在生理鹽水(PBS)中添加0.4％的羥丙基甲基纖維素(HPMC)配置細(xì)胞懸液，減少細(xì)胞在樣品池中聚集和在進(jìn)

6、樣通道中的貼壁，使肝癌細(xì)胞順利地在進(jìn)樣通道流動(dòng)。細(xì)胞流經(jīng)十字口時(shí)，在電壓作用下轉(zhuǎn)入分離通道，被分離通道中設(shè)置的圍堰截留，用含SDS的緩沖溶液迅速替換細(xì)胞周圍原有的PBS-HPMC介質(zhì)，然后使細(xì)胞在固定位置20s內(nèi)靜態(tài)溶膜。該圍堰的設(shè)置縮短了細(xì)胞溶膜的時(shí)間，提高了電泳分離時(shí)遷移時(shí)間的精密度。我們以肝癌細(xì)胞中的谷胱甘肽(GSH)和ROS為研究對(duì)象，對(duì)此類芯片的應(yīng)用進(jìn)行了檢驗(yàn)。此芯片可成功地用于檢測(cè)肝癌細(xì)胞，每小時(shí)可測(cè)定15個(gè)。連續(xù)測(cè)定10個(gè)

7、細(xì)胞，ROS遷移時(shí)間精密度為3.1％，GSH遷移時(shí)間精密度為4.9％。此類芯片制作簡(jiǎn)便，為單個(gè)腫瘤細(xì)胞以及其它易沉降易聚集易貼壁的細(xì)胞在微流控芯片上的分析提供了一個(gè)有效的平臺(tái)。 要檢測(cè)單細(xì)胞內(nèi)組分，大多需先衍生。為了避免衍生時(shí)細(xì)胞內(nèi)的痕量物質(zhì)被衍生劑進(jìn)一步稀釋，柱前細(xì)胞內(nèi)衍生法是最常見(jiàn)也是稀釋效應(yīng)最小的方法。然而，不是所有的衍生試劑都可進(jìn)入細(xì)胞，如FITC。本文探索了用小脂質(zhì)體包裹染料進(jìn)入細(xì)胞的方法，用超聲法制得大小均勻的平均直

8、徑為100納米的小脂質(zhì)體，探討了脂質(zhì)體過(guò)程中的影響因素及脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。用熒光顯微鏡拍攝圖片證明該脂質(zhì)體可以介導(dǎo)不透膜熒光染料FITC、RhodamineB進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體和細(xì)胞共培育，細(xì)胞內(nèi)熒光隨脂質(zhì)體和細(xì)胞培育的時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，在2h后基本達(dá)到平衡，實(shí)驗(yàn)證明脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞不影響細(xì)胞活性。用芯片毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)FITC脂質(zhì)體標(biāo)記后的細(xì)胞，得到多個(gè)電泳峰。說(shuō)明FITC在脂質(zhì)體介導(dǎo)下進(jìn)入細(xì)胞后可以標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的氨基酸和蛋白質(zhì)。

9、 超氧化物歧化酶(Superoxidediamutase，SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬蛋白，它能催化并清除細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子(O2.-)，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的氧化破壞，在解氧毒害、輻射損傷等方面具有重要作用。天然SOD由于其分子量較大，基本不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。超聲法制備包裹SOD的納米脂質(zhì)體，用芯片毛細(xì)管電泳測(cè)定SOD脂質(zhì)體投遞前后細(xì)胞內(nèi)的ROS和GSH，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和SOD脂質(zhì)體作用后，ROS含量下降，GSH含量升高，該實(shí)驗(yàn)