Pseudomonas stutzeri SDM催化特性及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、丙酮酸(pyruvicacid)是一種重要的醫(yī)藥、化工產(chǎn)品，其生產(chǎn)一直是生物化工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。酶催化法生產(chǎn)丙酮酸具有生產(chǎn)成本低、造成的污染少等優(yōu)點(diǎn)，成為關(guān)注的焦點(diǎn)。乳酸是生產(chǎn)丙酮酸的原材料之一，目前為止人們發(fā)現(xiàn)自然界存在三種可以催化乳酸生成丙酮酸的酶類，分別是：乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)，乳酸氧化酶(lactateoxidase，LOX)和細(xì)胞色素氧化酶b2(flavocytochromeb2，F(xiàn)C

2、B2)。其中FCB2研究較少，未見(jiàn)用于生產(chǎn)丙酮酸的報(bào)道。利用乳酸氧化酶生產(chǎn)丙酮酸已有報(bào)道，但由于在催化乳酸生成丙酮酸的過(guò)程中有過(guò)氧化氫的產(chǎn)生，導(dǎo)致丙酮酸的穩(wěn)定性降低，所以使該酶在丙酮酸生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。催化乳酸生成丙酮酸的脫氫酶是NAD+非依賴性的乳酸脫氫酶，該酶催化乳酸生成丙酮酸，不依賴NAD+為輔酶，同時(shí)催化過(guò)程沒(méi)有過(guò)氧化氫的生成，因此利用該酶生產(chǎn)丙酮酸具有廣闊的應(yīng)用前景。 酶催化法生產(chǎn)丙酮酸的核心是篩選具有高催化活性的

3、菌株，該菌株不僅具有催化合成丙酮酸的高活性的酶或酶系，同時(shí)要滿足催化條件簡(jiǎn)便易行，副產(chǎn)物少，后續(xù)加工程序簡(jiǎn)單等特性。研究該菌株的催化活性，確定關(guān)鍵酶的性質(zhì)和催化機(jī)理，確定參與的代謝途徑，對(duì)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件、提取純化關(guān)鍵酶蛋白、構(gòu)建相關(guān)的基因工程菌具有重要指導(dǎo)意義，并有助于最終達(dá)到提高轉(zhuǎn)化效率，提高丙酮酸產(chǎn)量的目的。 經(jīng)典的研究代謝途徑的方法是推測(cè)和驗(yàn)證相結(jié)合，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展，利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究代謝途徑已經(jīng)逐步代替了以往的方

4、法，雙向電泳技術(shù)自1975年問(wèn)世以來(lái)已經(jīng)成為一種分離蛋白質(zhì)的有效工具，伴隨著基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜分析技術(shù)(matrixassistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOFMS)的廣泛應(yīng)用，使得蛋白質(zhì)鑒定變得較可行。并在一定條件下對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行分析為研究代謝網(wǎng)絡(luò)的組成及功能提供了重要的信息；另外酶活性的測(cè)定也是探討代謝通路的途徑之一。

5、 PseudomonasstutzeriSDM由本實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選得到，DL-乳酸是該菌的最佳碳源，在含有DL-乳酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并收集菌體作為休止細(xì)胞進(jìn)行DL-乳酸的轉(zhuǎn)化，最初轉(zhuǎn)化體系中DL-乳酸的量是25.51g/L，30℃轉(zhuǎn)化36小時(shí)后，檢測(cè)到體系中丙酮酸的積累量是22.61g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到88.6﹪(w/w)，同時(shí)在轉(zhuǎn)化液中檢測(cè)到檸檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和乙酸等有機(jī)酸。此屬首次發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬細(xì)胞具有生產(chǎn)丙

6、酮酸的能力，由于培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，發(fā)酵液成分單一，轉(zhuǎn)化率高，所以具有很廣闊的應(yīng)用前景。 利用雙向電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜分析技術(shù)，首次得到了P.stutzeriSDM全細(xì)胞裂解液的雙向電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis，2DE)譜圖。對(duì)2DE譜圖上重現(xiàn)率高的可視點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切，得到部分蛋白的肽質(zhì)量指紋譜(PMF)，與假蛋白菌屬已有PMF數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定到匹配率高的蛋白質(zhì)95種，其中14

7、種蛋白質(zhì)與乳酸氧化成丙酮酸過(guò)程相關(guān)，其中包括兩種乳酸脫氫酶，分別是D-lactatedehydrogenase和L-lactatedehydrogenase(FMN-dependent)，從MALDI-TOF分析結(jié)果得到兩種酶的分子量分別是45,394Da和66,540Da。從蛋白質(zhì)鑒定的水平上確定了氧化乳酸生成丙酮酸的關(guān)鍵酶是NAD+非依賴的乳酸脫氫酶(NAD+-independentlactatedehydrogenase，iLDH

8、)，此屬首次在假單胞菌屬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)iLDH。結(jié)合轉(zhuǎn)化液中間產(chǎn)物的測(cè)定，初步確定乳酸氧化產(chǎn)生能量的過(guò)程通過(guò)三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)。該研究填補(bǔ)了P.stutzeriSDM代謝途徑研究的空白，第一次建立了該菌的雙向電泳圖譜，首次完成了部分蛋白質(zhì)的鑒定，為進(jìn)一步優(yōu)化P.stutzeriSDM轉(zhuǎn)化乳酸的過(guò)程并提高丙酮酸的產(chǎn)量提供理論依據(jù)，也為今后分離純化氧化乳酸的關(guān)鍵酶提供了重要線索。 P.stutzeriSDM在含有乳酸為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

9、，菌體細(xì)胞利用并氧化乳酸生成丙酮酸的酶是NAD+非依賴性的乳酸脫氫酶(NAD+-independentlactatedehydrogenase，iLDH)，對(duì)細(xì)胞不同組分的酶活性測(cè)定表明，iLDH的活性定位在細(xì)胞膜上，并且發(fā)現(xiàn)在膜上同時(shí)存在兩種立體異構(gòu)專一性的酶：L-iLDH和D-iLDH。用含有不同碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，結(jié)果顯示兩種酶都是非組成型的表達(dá)蛋白，任何一種對(duì)映體的乳酸都可以誘導(dǎo)兩種酶的表達(dá)。酶促動(dòng)力學(xué)研究表明，P.stutz

10、eri中iLDH催化的反應(yīng)遵循Michaelis-Menten模型，L-iLDH的米氏常數(shù)比D-iLDH的米氏常數(shù)高，兩種酶的氧化速度不同，并且各有特異的電子受體，不同的電子受體又各有特定的抑制劑。L-iLDH的活性在55℃時(shí)穩(wěn)定性比D-iLDH的穩(wěn)定性好，D-iLDH在55℃變性失去活性。iLDH對(duì)底物有嚴(yán)格的選擇性，草氨酸完全抑制兩種iLDH的活性，草酸表現(xiàn)為混合型的抑制作用。Mg2+是iLDH的金屬離子激活劑，Cu2+和Mn2+是

11、其金屬離子抑制劑。我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)P.stutzeriSDM利用含有乳酸和葡萄糖混合培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，只有當(dāng)乳酸消耗盡時(shí)才利用葡萄糖，具有優(yōu)先利用乳酸的特點(diǎn)。上述得出的iLDH活性調(diào)節(jié)的結(jié)論為進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)條件包括溫度pH等因素的探索提供了理論依據(jù)，并為提高丙酮酸轉(zhuǎn)化效率奠定了基礎(chǔ)。 針對(duì)雙向電泳過(guò)程中膜蛋白質(zhì)組研究面臨的問(wèn)題，通過(guò)不同表面活性劑對(duì)膜組分作用的不同，本實(shí)驗(yàn)探討了幾種富集P.stutzeriSDM膜蛋白的方法。

12、通過(guò)超速離心的方法純化得到膜蛋白，采取裂解液直接溶解的方法和分別用TritonX-100、CHAPS、SLS、SDS溶解的方法處理，然后用TCA-丙酮沉淀的方法從上清中沉淀蛋白，分別進(jìn)行雙向電泳，得到五種不同處理方法下的膜蛋白的2DE圖譜，對(duì)2DE圖譜分析可見(jiàn)，不同的表面活性劑對(duì)膜蛋白的溶解有選擇性，TritonX-100的2DE圖譜無(wú)論從蛋白質(zhì)點(diǎn)的形狀以及蛋白點(diǎn)的數(shù)量等均優(yōu)于其它處理組。結(jié)合MALDI-TOFMS分析技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定

13、，膜蛋白直接用裂解液溶解的樣品得到匹配率高于75﹪的蛋白質(zhì)20種，TritonX-100鑒定到的蛋白質(zhì)種類較多，共46種。利用十二烷基肌氨酸處理膜蛋白，鑒定到蛋白質(zhì)28種，其中外膜蛋白為15種，占鑒定到蛋白質(zhì)的58﹪，十二烷基肌氨酸是提取制備外膜蛋白最佳的選擇。鑒定到的蛋白質(zhì)中以酸性和中性蛋白質(zhì)居多，堿性蛋白較少，故選擇表面活性劑處理的方法有其局限性。 應(yīng)用雙向電泳技術(shù)鑒定疏水性的膜蛋白，由于在第一向等電聚焦時(shí)許多蛋白質(zhì)發(fā)生了沉

14、淀而使其在膜蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用受到了限制，本實(shí)驗(yàn)利用非變性藍(lán)色聚丙烯酰胺凝膠電泳(bluenativepolyacrylamidegelelectrophoresis，BN-PAGE)技術(shù)對(duì)純化得到的膜蛋白進(jìn)行了分離，探討了一種溫和的表面活性劑十二烷基麥芽糖苷(DM)對(duì)膜蛋白的溶解作用，通過(guò)不同濃度DM對(duì)P.stutzeriSDM膜蛋白作用差異的比較，結(jié)合iLDH活性檢測(cè)，確定2﹪的DM濃度是最佳選擇。第一向bluenativePAG

15、E采用了CCBG250提供離子基團(tuán)對(duì)膜蛋白進(jìn)行了初步分離，進(jìn)而第二向SDS-PAGE對(duì)第一向初步分離的條帶進(jìn)行了再次分離，得到了較為單一的蛋白質(zhì)點(diǎn)。成功建立了iLDH活性染色方法，對(duì)電泳結(jié)束后的膠進(jìn)行活性染色，得到了單一的活性點(diǎn)。首次利用2DBN/SDS-PAGE的方法處理P.stutzeriSDM的膜蛋白，并結(jié)合MALDI-TOF-MS分析技術(shù)，鑒定到29種膜蛋白，與通過(guò)2DE方法分離鑒定到的蛋白沒(méi)有重疊性，彌補(bǔ)了通過(guò)經(jīng)典的2DE方法

16、鑒定膜蛋白的不足。結(jié)果證明利用BN-PAGE結(jié)合SDS-PAGE，并利用質(zhì)譜分析手段，對(duì)于疏水性較強(qiáng)的膜蛋白來(lái)說(shuō)，是一種相對(duì)廉價(jià)、直接、快速的分析手段。 P.stutzeriSDM以乳酸為唯一碳源時(shí)生長(zhǎng)最好，并且是唯一可以產(chǎn)生并積累丙酮酸的培養(yǎng)基，在乙醇為唯一碳源時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，幾乎沒(méi)有丙酮酸的產(chǎn)生。本文依賴雙向電泳和MALDI-TOFMS技術(shù)，從比較蛋白質(zhì)組學(xué)的角度揭示了不同碳源條件對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白表達(dá)差異點(diǎn)進(jìn)行