益生菌Lactobacillus casei Zhang蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、乳酸菌廣泛存在于動物、植物及自然環(huán)境中，是同人類生活和生產(chǎn)密切相關(guān)的重要微生物之一。LactobacilluscaseiZhang是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點實驗室篩選自內(nèi)蒙地區(qū)、蒙古國和新疆地區(qū)牧民家庭以傳統(tǒng)方法制作的自然發(fā)酵酸馬奶中，研究表明，該菌株具有許多重要益生性狀和功能，尤其是對酸和膽鹽具有較強的耐受性，是乳酸菌研究和益生菌開發(fā)利用的理想菌種。 此項研究從蛋白質(zhì)組的水平，對益生菌L．caseiZha

2、ng在膽鹽和酸脅迫下蛋白質(zhì)差異表達及其分子機制進行了探討。將蛋白質(zhì)組學技術(shù)與基因組學、代謝組學、傳統(tǒng)生物學技術(shù)等相結(jié)合，為研究乳酸菌對環(huán)境脅迫的反應(yīng)、耐受和適應(yīng)機制，為益生菌分離篩選、開發(fā)推廣，提供了較為全面系統(tǒng)的研究思路。 研究利用液氮研磨法成功分離提取了L．caseiZhang菌體蛋白質(zhì)，系統(tǒng)優(yōu)化了干酪乳桿菌蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)（2—DE），使之有效地用于干酪乳桿菌雙向凝膠電泳圖譜的構(gòu)建。利用上述方法和技術(shù)，研究首先建立

3、了L．caseiZhang和對比菌株L．caseiXM2-1在pl4—7范圍內(nèi)不同生長階段的全蛋白質(zhì)表達圖譜，并且比較了L．caseiZhang在膽鹽和酸脅迫下差異表達蛋白質(zhì)圖譜。經(jīng)過比較分析，研究利用質(zhì)譜檢測技術(shù)和生物信息學技術(shù)對其中差異表達蛋白質(zhì)進行了鑒定、功能分類和代謝途徑分析等。同時，利用實時熒光定量PCR技術(shù)對某些差異表達蛋白質(zhì)的相應(yīng)基因進行了mRNA水平的分析與驗證。結(jié)果表明： 經(jīng)過對L．caseiZhang在對數(shù)生

4、長期與穩(wěn)定期雙向凝膠電泳圖譜分析顯示，利用優(yōu)化的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳技術(shù)可以分離到L．caseiZhang約500個蛋白點，通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI—TOF/MS）鑒定出110種蛋白質(zhì)，并對蛋白質(zhì)功能、密碼子偏好性、蛋白疏水性等進行了分析，從而構(gòu)建了L．caseiZhang的參考雙向凝膠電泳圖譜。 進一步比較分析L．caseiZhang對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的2—DE圖譜表明，47種蛋白質(zhì)在L．caseiZh

5、ang不同生長階段的表達變化明顯，其中33種蛋白質(zhì)在穩(wěn)定期時的蛋白表達量比對數(shù)生長期增強至少2.5倍，包括Dnak、GroEL、LuxS、PK和GaIU等19種蛋白質(zhì)表達量增強在3.0倍以上；此外，6種蛋白質(zhì)表達量在穩(wěn)定期下降2.5倍以上；2種蛋白質(zhì)只在對數(shù)生長中期表達；8種蛋白質(zhì)只發(fā)現(xiàn)于穩(wěn)定期圖譜中。根據(jù)功能分類，這些差異蛋白質(zhì)主要為應(yīng)激蛋白及代謝相關(guān)蛋白，可能與L．caseiZhang穩(wěn)定期對環(huán)境變化具有較強耐受性有密切關(guān)系。同時，

6、研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)對其中的8個差異蛋白質(zhì)，包括DnaK、GroEL、Hsp20-1、Hsp20—2、Galactosemutarotaserelatedenzyme、BetasubunitofpyruvatedehydrogenasecomplexE1componen、UDP—glucosepyrophosphorylase和EsteraseC的相應(yīng)基因進行了mRNA水平的動態(tài)變化分析，顯示不同的基因具有的不同表達模式。而對

7、比菌株L．caseiXM2-1與L．caseiZhang的雙向凝膠電泳圖譜非常相似，說明了它們是同一種屬，但是存在菌株間差異表達蛋白質(zhì)。L．caseiXM2-1在對數(shù)生長期與穩(wěn)定期雙向凝膠電泳圖譜分析表明，有16種蛋白質(zhì)表達變化明顯，其中12種蛋白質(zhì)在穩(wěn)定期表達強度增強2倍以上，而有2種蛋白質(zhì)表達量在穩(wěn)定期下降。 利用雙向凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，研究從蛋白質(zhì)組的水平對L．caseiZhang在膽鹽脅迫下的蛋白質(zhì)差異表達情況及其膽

8、鹽耐受機制進行了初步探索。結(jié)果表明，與不含膽鹽正常生長至對數(shù)生長中期的菌體相比，L．caseiZhang在含有1.5％膽鹽的培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長期中期，有26種蛋白質(zhì)表達發(fā)生了變化，其中包括應(yīng)激蛋白、糖代謝蛋白、肽酶、氨基酸代謝蛋白、轉(zhuǎn)錄蛋白、核糖體蛋白、核酸代謝蛋白和脂肪代謝蛋白等，說明L．caseiZhang應(yīng)對膽鹽應(yīng)激具有復(fù)雜的調(diào)控機制，不是一種或幾種蛋白質(zhì)發(fā)生作用。經(jīng)過實時熒光定量PCR驗證和短時間膽鹽脅迫蛋白質(zhì)組研究，其中與

9、應(yīng)激作用、維持細胞膜穩(wěn)定性及抗氧化等機制相關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)可能在L．caseiZhang耐膽鹽中起到非常重要的作用。此外，在研究中還發(fā)現(xiàn)，GroEL、DnaK、UspA、GalU、NagA、LuxS、EF—Tu和30SribosomalproteinS2等蛋白質(zhì)在L．caseiZhang穩(wěn)定期蛋白質(zhì)組比較中表達量也增強，也許暗示膽鹽與酸應(yīng)激對干酪乳桿菌有某些相似的脅迫作用，從而誘導(dǎo)了共同的應(yīng)激機制。但是，膽鹽和酸脅迫這兩種不同的環(huán)境壓力也可

10、誘導(dǎo)L．caseiZhang產(chǎn)生不同的特異性表達差異蛋白質(zhì)，也表明了不同脅迫可能對L．caseiZhang產(chǎn)生不同的影響。 L．caseiZhang和對比菌株LcaseiXM2-1酸脅迫下生長蛋白質(zhì)變化結(jié)果顯示，在不同pH值條件下生長時，分別有15種和14種蛋白質(zhì)表達發(fā)生了變化，主要包括應(yīng)激蛋白、脂酶、翻譯因子等。兩株菌在不同pH值下生長雖然有相似的蛋白差異點，但也有個別差異蛋白質(zhì)表現(xiàn)出菌株依賴性，可能是不同菌株在酸脅迫下特異性