利用熒光光譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)間的相互作用.pdf

1、生命體中細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)、酶促代謝、涉及氧化還原的呼吸等很多生物化學(xué)反應(yīng)過程都是在蛋白-蛋白相互作用的基礎(chǔ)上完成的。對(duì)蛋白-蛋白相互作用過程的深入研究對(duì)于理解和揭示細(xì)胞的功能調(diào)控機(jī)制及疾病控制與治療等方面都具有十分重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　生物在進(jìn)化的過程中，逐步形成了在感受外界脅迫下，利用自身調(diào)節(jié)體系來適應(yīng)環(huán)境的變化。而在調(diào)節(jié)的信號(hào)傳遞中，激酶對(duì)底物的修飾或蛋白間氧化還原狀態(tài)的轉(zhuǎn)化等都是動(dòng)態(tài)作用過程。這些作用

2、過程很難用Pull-down，免疫共沉淀和熒光共定位等傳統(tǒng)方法來驗(yàn)證。本論文主要以光譜技術(shù)研究蛋白之間的相互作用，內(nèi)容包括:
　　(1)以谷胱甘肽過氧化物酶(AtGPX3)和硫氧還蛋白(TRX)為研究體系。利用蛋白質(zhì)定點(diǎn)突變、內(nèi)稟熒光探針（色氨酸）和人工熒光探針—TF3、TF5(Cy3、Cy5的升級(jí)替代產(chǎn)品)的熒光光譜以及蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)等方法和技術(shù)來研究蛋白相互作用中的電子轉(zhuǎn)移模式以及

3、蛋白質(zhì)氧化態(tài)還原態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果確定了谷胱甘肽過氧化物酶(GPX3)和硫氧還蛋白(TRX)的兩種不同狀態(tài)，對(duì)應(yīng)不同的氧化還原特性;結(jié)合基因點(diǎn)突變技術(shù)，證實(shí)了GPX3和TRX相互作用時(shí)，二者之間電子傳遞模式是GPX3將電子傳遞給TRX，而并不是像通常情況下的TRX作為供氫體存在。
　　(2)以擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶(AtGPX3)和硫氧還蛋白(AtTRX9)為研究體系，利用蛋白熒光標(biāo)記技術(shù)，單分子多通道全內(nèi)反射熒光顯微(

4、TIRFM)系統(tǒng)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等技術(shù)，在體相和單分子水平上研究了兩種蛋白間的相互作用。通過觀測(cè)蛋白內(nèi)稟色氨酸的熒光光譜變化，以及熒光探針標(biāo)記后AtGPX3和AtTRX9蛋白之間的FRET效應(yīng)，獲得了蛋白之間存在相互作用的直接證據(jù)，并討論了相關(guān)的科學(xué)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，擬南芥谷胱甘肽過氧化物酶(AtGPX3)、硫氧還蛋白(AtTRX9)在不同環(huán)境下的不同狀態(tài)以及不同的氧化還原特性，證明了氧化態(tài)的AtGPX3與還原態(tài)的AtT