多層鍵合磷酸鋯開管毛細(xì)管柱制備及在磷酸肽富集分析中的應(yīng)用.pdf

1、可逆的磷酸化過程在細(xì)胞增殖、分化、代謝、細(xì)胞間通訊以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等重要的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，真核細(xì)胞中，有近25-30％的蛋白在其生活史中會(huì)經(jīng)歷磷酸化過程。因此，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是翻譯后修飾蛋白質(zhì)組研究中的熱點(diǎn)之一。目前，包括MALDI源和ESI源在內(nèi)的質(zhì)譜儀以其高靈敏度、準(zhǔn)確度和分辨率而被廣泛用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。由于磷酸化蛋白在生物體內(nèi)含量很低，且在質(zhì)譜分析時(shí)易受到非磷酸肽的干擾，因而磷酸肽和磷酸化蛋白質(zhì)的富集成為

2、磷酸化肽段和磷酸化蛋白質(zhì)分析的一個(gè)關(guān)鍵步驟。目前已經(jīng)有很多富集磷酸肽的方法和技術(shù)，但這些方法在應(yīng)用時(shí)仍然存在不少問題，因而需要發(fā)展新的富集方法，以滿足大規(guī)模磷酸化蛋白質(zhì)組分析的需要?；诖?，本文開展了一種磷酸肽富集的新方法研究，并將其應(yīng)用于復(fù)雜樣品的分析。
　　 本課題發(fā)展的方法為一種利用鍵合磷酸鋯開管毛細(xì)管柱的制備及用于快速富集磷酸肽的新方法。其過程是通過酸堿活化熔融石英毛細(xì)管內(nèi)表面，使其帶有自由的硅羥基，在硅羥基表面引入3-

3、氨丙基三乙氧基硅烷，之后再分別引入甲基丙烯酸甲酯和乙二胺，如此進(jìn)行三輪反應(yīng)后，在形成的樹枝狀大分子表面進(jìn)行磷酸基團(tuán)修飾并與鋯離子生成磷酸鹽，最終合成具有特異性吸附磷酸肽分子的多層開管毛細(xì)管柱。
　　 進(jìn)一步對(duì)該多層開管毛細(xì)管柱的富集條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定出當(dāng)開管毛細(xì)管柱長(zhǎng)度為50 cm時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)磷酸肽的進(jìn)樣流速在0.3 μL/min-0.5μL/min時(shí)，均有很好的富集效果。并且在同樣的流速條件下，使用不同內(nèi)徑的多層開管柱進(jìn)行富集時(shí)

4、，富集效果沒有顯著性差異。同時(shí)還考察了強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜分離中分離效果較好的鹽，如氯化銨對(duì)富集效果的影響，以便該方法與復(fù)雜樣本的預(yù)分離過程相兼容。之后，還用合成的磷酸肽段(FLpTEYVATR)與外標(biāo)法相結(jié)合，對(duì)開管毛細(xì)管柱的負(fù)載量和回收率等進(jìn)行考察，確定出負(fù)載量為48 pmol，回收率為94.1％（50 cm×50 μm）。利用α酪蛋白與BSA混合酶切溶液，考察了毛細(xì)管開管柱的選擇性和檢測(cè)靈敏度，結(jié)果表明此方法對(duì)磷酸肽有較高的選擇性，且