毛細(xì)管電泳與化學(xué)發(fā)光-生物發(fā)光聯(lián)用技術(shù)用于單細(xì)胞分析.pdf

1、單個(gè)細(xì)胞的分析化學(xué)正在形成, 它已成為分析化學(xué)前沿領(lǐng)域中的熱門課題。單細(xì)胞分析將人們對生物微環(huán)境的認(rèn)識(shí)提升到一個(gè)更深的更清晰的層次。比起常規(guī)細(xì)胞分析，單細(xì)胞分析注重細(xì)胞個(gè)體間的差異，可以檢測到被平均結(jié)果所掩蓋掉的重要生物信息，這在疾病早期的診斷和預(yù)防方面是非常重要的。而且對作為一個(gè)相對獨(dú)立生物功能體的單細(xì)胞中的一些重要組分進(jìn)行高效、靈敏地檢測，將有助于闡明一些重要的細(xì)胞生理過程。在單細(xì)胞分析方法方面，高效液相色譜法以及80年代發(fā)展起來的

2、開管液相色譜和毛細(xì)管電泳(CE)微柱分離方法由于質(zhì)量檢測限低、分離效率高, 已成功地用于單細(xì)胞多組分的定量檢測。其中，由于CE進(jìn)樣量小, 可操作性強(qiáng), 分離快速、高效, 因而它在單細(xì)胞的多組分分析中發(fā)揮著越來越重要的作用。到目前為止，在眾多CE聯(lián)用檢測方法中，激光誘導(dǎo)熒光檢測和電化學(xué)檢測與CE聯(lián)用方法成為主要的單細(xì)胞分析工具。但由于這兩種方法儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有時(shí)還需對無熒光或者無電活性的組分進(jìn)行衍生，操作比較繁瑣，所以有待人們探索新的用于

3、單細(xì)胞分析的方法。CE-CL方法和CE-BL方法結(jié)合了CE的高效分離優(yōu)勢以及CL、BL檢測方法的超高靈敏、簡單易行等優(yōu)勢，將為單細(xì)胞分析提供新的分析方法的選擇。 本文探索了毛細(xì)管電泳與化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用方法（CE-CL）以及毛細(xì)管電泳與生物發(fā)光檢測聯(lián)用方法（CE-BL）用于單細(xì)胞分析的可行性，用以為目前的單細(xì)胞分析提供兩種新的分析方法，使人們可以從更多的側(cè)面對目標(biāo)細(xì)胞有所了解，從而更加清晰的掌握細(xì)胞的生命過程以及和細(xì)胞相關(guān)的生理過

4、程。 在本文中，選定具有重要生理以及臨床意義的人體血紅細(xì)胞作為單細(xì)胞分析的對象，首先探索了采用CE-CL方法對其內(nèi)部重要的功能組分－血紅蛋白（Hb）－進(jìn)行定性定量分析的可行性： 1. 根據(jù)課題組以往的研究結(jié)果，選用具有超高檢測靈敏度的魯米諾－過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系作為血紅蛋白的檢測體系。 2. 為了提高檢測體系檢測血紅蛋白的靈敏度以達(dá)到可以檢測單個(gè)血紅細(xì)胞的水平，在CE-CL條件下，對檢測體系中諸如檢測模式、試

5、劑混合模式、緩沖溶液pH值、反應(yīng)試劑濃度以及檢測位置等重要因素進(jìn)行了優(yōu)化。 3. 將人體血液直接稀釋作為樣品，應(yīng)用優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件對六個(gè)不同濃度的血紅蛋白樣品進(jìn)行了分離檢測并繪制了樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍在1.7 mg mL-1 到 6.8 mg mL-1之間，線性系數(shù)為0.997，檢測限達(dá)到0.17mg mL-1（大約2.2pg，S/N=3）。 4. 摸索對血紅細(xì)胞的操作條件，簡化細(xì)胞進(jìn)樣操作。在以往的單細(xì)胞分析中，細(xì)

6、胞進(jìn)樣需要使用倒置生物顯微鏡甚至三維微操作器的輔助，雖然倒置生物顯微鏡可以為細(xì)胞分析提供更廣闊的操作平臺(tái)，但其價(jià)格也十分昂貴。發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有資源的優(yōu)勢，使用一臺(tái)普通生物顯微鏡以及自行設(shè)計(jì)的細(xì)胞進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)了單個(gè)血紅細(xì)胞進(jìn)樣。這個(gè)方法簡單、廉價(jià)而且省時(shí)，一般30s便可完成細(xì)胞進(jìn)樣。 5. 完成了若干單個(gè)血紅細(xì)胞的進(jìn)樣以及檢測，得到比較強(qiáng)烈的信號(hào)。為了進(jìn)一步考察方法的可靠性，連續(xù)對26個(gè)單個(gè)血紅細(xì)胞進(jìn)樣檢測，將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到這

7、26個(gè)血紅細(xì)胞中血紅蛋白的平均含量是23.6pg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為21.5％。 這是首次將CE-CL方法應(yīng)用于單細(xì)胞分析。在成功實(shí)現(xiàn)CE-CL方法檢測單細(xì)胞中血紅蛋白的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索了采用CE-BL方法對單個(gè)血紅細(xì)胞中另一重要的功能組分－三磷酸腺苷（ATP）－進(jìn)行定性定量分析的可行性： 1.采用專屬性較強(qiáng)，檢測靈敏度超高的熒光素酶生物發(fā)光反應(yīng)體系作為ATP的檢測體系。 2.首次將毛細(xì)管電泳與生物發(fā)光檢

8、測相聯(lián)用。考慮到這個(gè)檢測體系中相互作用因素較多，而且易受雜質(zhì)干擾而被猝滅，所以首先我們對檢測體系中諸如試劑中的含氧量，熒光素酶緩沖溶液體系的基底、pH值、流速以及熒光素酶緩沖溶液體系中不同陰離子對體系的猝滅作用、增強(qiáng)劑濃度等重要因素進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。 3.在優(yōu)化好的CE-BL實(shí)驗(yàn)條件下，對不同濃度的ATP樣品進(jìn)行了進(jìn)行了定量分析。得到樣品的線性范圍為1～50mM，線性相關(guān)系數(shù)為0.99988，遷移時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RS