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文檔簡介
1、單個(gè)細(xì)胞的分析化學(xué)正在形成, 它已成為分析化學(xué)前沿領(lǐng)域中的熱門課題。單細(xì)胞分析將人們對生物微環(huán)境的認(rèn)識(shí)提升到一個(gè)更深的更清晰的層次。比起常規(guī)細(xì)胞分析,單細(xì)胞分析注重細(xì)胞個(gè)體間的差異,可以檢測到被平均結(jié)果所掩蓋掉的重要生物信息,這在疾病早期的診斷和預(yù)防方面是非常重要的。而且對作為一個(gè)相對獨(dú)立生物功能體的單細(xì)胞中的一些重要組分進(jìn)行高效、靈敏地檢測,將有助于闡明一些重要的細(xì)胞生理過程。在單細(xì)胞分析方法方面,高效液相色譜法以及80年代發(fā)展起來的
2、開管液相色譜和毛細(xì)管電泳(CE)微柱分離方法由于質(zhì)量檢測限低、分離效率高, 已成功地用于單細(xì)胞多組分的定量檢測。其中,由于CE進(jìn)樣量小, 可操作性強(qiáng), 分離快速、高效, 因而它在單細(xì)胞的多組分分析中發(fā)揮著越來越重要的作用。到目前為止,在眾多CE聯(lián)用檢測方法中,激光誘導(dǎo)熒光檢測和電化學(xué)檢測與CE聯(lián)用方法成為主要的單細(xì)胞分析工具。但由于這兩種方法儀器結(jié)構(gòu)復(fù)雜,有時(shí)還需對無熒光或者無電活性的組分進(jìn)行衍生,操作比較繁瑣,所以有待人們探索新的用于
3、單細(xì)胞分析的方法。CE-CL方法和CE-BL方法結(jié)合了CE的高效分離優(yōu)勢以及CL、BL檢測方法的超高靈敏、簡單易行等優(yōu)勢,將為單細(xì)胞分析提供新的分析方法的選擇。 本文探索了毛細(xì)管電泳與化學(xué)發(fā)光檢測聯(lián)用方法(CE-CL)以及毛細(xì)管電泳與生物發(fā)光檢測聯(lián)用方法(CE-BL)用于單細(xì)胞分析的可行性,用以為目前的單細(xì)胞分析提供兩種新的分析方法,使人們可以從更多的側(cè)面對目標(biāo)細(xì)胞有所了解,從而更加清晰的掌握細(xì)胞的生命過程以及和細(xì)胞相關(guān)的生理過
4、程。 在本文中,選定具有重要生理以及臨床意義的人體血紅細(xì)胞作為單細(xì)胞分析的對象,首先探索了采用CE-CL方法對其內(nèi)部重要的功能組分-血紅蛋白(Hb)-進(jìn)行定性定量分析的可行性: 1. 根據(jù)課題組以往的研究結(jié)果,選用具有超高檢測靈敏度的魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系作為血紅蛋白的檢測體系。 2. 為了提高檢測體系檢測血紅蛋白的靈敏度以達(dá)到可以檢測單個(gè)血紅細(xì)胞的水平,在CE-CL條件下,對檢測體系中諸如檢測模式、試
5、劑混合模式、緩沖溶液pH值、反應(yīng)試劑濃度以及檢測位置等重要因素進(jìn)行了優(yōu)化。 3. 將人體血液直接稀釋作為樣品,應(yīng)用優(yōu)化好的實(shí)驗(yàn)條件對六個(gè)不同濃度的血紅蛋白樣品進(jìn)行了分離檢測并繪制了樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性范圍在1.7 mg mL-1 到 6.8 mg mL-1之間,線性系數(shù)為0.997,檢測限達(dá)到0.17mg mL-1(大約2.2pg,S/N=3)。 4. 摸索對血紅細(xì)胞的操作條件,簡化細(xì)胞進(jìn)樣操作。在以往的單細(xì)胞分析中,細(xì)
6、胞進(jìn)樣需要使用倒置生物顯微鏡甚至三維微操作器的輔助,雖然倒置生物顯微鏡可以為細(xì)胞分析提供更廣闊的操作平臺(tái),但其價(jià)格也十分昂貴。發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有資源的優(yōu)勢,使用一臺(tái)普通生物顯微鏡以及自行設(shè)計(jì)的細(xì)胞進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)了單個(gè)血紅細(xì)胞進(jìn)樣。這個(gè)方法簡單、廉價(jià)而且省時(shí),一般30s便可完成細(xì)胞進(jìn)樣。 5. 完成了若干單個(gè)血紅細(xì)胞的進(jìn)樣以及檢測,得到比較強(qiáng)烈的信號(hào)。為了進(jìn)一步考察方法的可靠性,連續(xù)對26個(gè)單個(gè)血紅細(xì)胞進(jìn)樣檢測,將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到這
7、26個(gè)血紅細(xì)胞中血紅蛋白的平均含量是23.6pg,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為21.5%。 這是首次將CE-CL方法應(yīng)用于單細(xì)胞分析。在成功實(shí)現(xiàn)CE-CL方法檢測單細(xì)胞中血紅蛋白的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探索了采用CE-BL方法對單個(gè)血紅細(xì)胞中另一重要的功能組分-三磷酸腺苷(ATP)-進(jìn)行定性定量分析的可行性: 1.采用專屬性較強(qiáng),檢測靈敏度超高的熒光素酶生物發(fā)光反應(yīng)體系作為ATP的檢測體系。 2.首次將毛細(xì)管電泳與生物發(fā)光檢
8、測相聯(lián)用。考慮到這個(gè)檢測體系中相互作用因素較多,而且易受雜質(zhì)干擾而被猝滅,所以首先我們對檢測體系中諸如試劑中的含氧量,熒光素酶緩沖溶液體系的基底、pH值、流速以及熒光素酶緩沖溶液體系中不同陰離子對體系的猝滅作用、增強(qiáng)劑濃度等重要因素進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化。 3.在優(yōu)化好的CE-BL實(shí)驗(yàn)條件下,對不同濃度的ATP樣品進(jìn)行了進(jìn)行了定量分析。得到樣品的線性范圍為1~50mM,線性相關(guān)系數(shù)為0.99988,遷移時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RS
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