甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育恢復(fù)基因BnMs5a的克隆.pdf

1、Rs1046AB是派生于宜3A的細(xì)胞核雄性不育系，遺傳分析表明Rs1046AB的育性受一個復(fù)等位基因位點(diǎn)控制，它們的顯隱性關(guān)系為恢復(fù)基因型（BnMs5a）＞不育基因型（BnMs5b）＞保持基因型（BnMsc）（洪登峰，2006）。利用Rs1046AB中的不育株Rs1046A與其恢復(fù)系19514A雜交構(gòu)建的一個F2作圖群體，本課題組已將BnMs5位點(diǎn)定位于標(biāo)記SCD8和SC6之間1.1cM的遺傳區(qū)間內(nèi)。并以BnMs5兩側(cè)最近標(biāo)記SCD8和

2、SC6為探針篩選了甘藍(lán)型油菜Tapidor（在BnMs5位點(diǎn)基因型為BnMs5c）BAC文庫，獲得了可能覆蓋目標(biāo)基因區(qū)段的29個陽性克隆。為了克隆該不育基因位點(diǎn)并解析其育性遺傳的分子機(jī)理，本研究對上述陽性克隆分組和測序，開發(fā)出一個與BnMs5緊密連鎖的標(biāo)記，從而將BnMs5定位在一個BAC克隆上約21-kb的物理區(qū)段內(nèi)，并最終通過遺傳互補(bǔ)實驗證實其中一個候選基因即為BnMs5位點(diǎn)的目標(biāo)基因。其主要結(jié)果如下:
　　 1.BnMs5

3、位點(diǎn)起源。利用12個與BnMs5連鎖標(biāo)記的序列比對白菜和甘藍(lán)全基因組序列，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)標(biāo)記能夠在白菜MF2亞基因組及甘藍(lán)subgenomeⅡ亞基因組的鑒定出高度同源區(qū)，且這些同源區(qū)在白菜或甘藍(lán)基因組上的排列順序與上述標(biāo)記在BnMs5附近的排列順序基本一致。與BnMs5連鎖的標(biāo)記SCD2亦可定位在甘藍(lán)型油菜TNDH群體（Long et al.，2007）的A8染色體上。因此，推測BnMs5位點(diǎn)起源于白菜MF2亞基因組。
　　 2.

4、目標(biāo)BAC克隆鑒定。利用7組位于候選基因區(qū)段的亞基因組特異或保守的PCR引物將可能包含BnMs5位點(diǎn)的29個陽性克隆分為6組。在獲得第Ⅰ組中編號為JBnB007P02的BAC克隆的插入片段序列后，開發(fā)出BnMs5一側(cè)最近且在F2群體中呈共顯性遺傳的標(biāo)記BE10。利用BE10重新分析上述6組BAC克隆后確認(rèn)目標(biāo)BAC克隆位于第Ⅲ組中，而第Ⅰ組克隆中的JBnB007P02則是和目標(biāo)區(qū)段高度同源的拷貝。
　　 3.候選基因預(yù)測。以白菜

5、已測序BAC克隆KBrB111O21的序列為參考，從第Ⅲ組編號為JBnB034L06的BAC克隆中分離了兩側(cè)最近標(biāo)記SCD8-2和BE10之間的完整序列。基因預(yù)測顯示該21-kb的候選基因區(qū)段包含8個潛在的開放讀碼框。除ORF2和ORF3為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子相關(guān)基因外，其余6個開放讀碼框都可能為BnMs5的候選基因。
　　 4.親本中候選基因序列分離。參考JBnB034L06的可利用信息，從定位群體親本Rs1046A和19514A中分

6、離出候選區(qū)段內(nèi)的大部分序列及部分目標(biāo)拷貝特異的標(biāo)記。利用上述標(biāo)記錨定的長片段PCR（以預(yù)測的全長基因為單位）成功的從兩親本中分別克隆到包含ORF4、ORF5、ORF6、ORF7和ORF8完整基因的序列。
　　 5.候選基因的遺傳轉(zhuǎn)化與功能互補(bǔ)。將上述分離的各候選基因片段分別克隆到表達(dá)載體pFGC5941中構(gòu)建互補(bǔ)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化相應(yīng)的受體材料（全不育系或臨保系）。對T0代陽性單株的表型鑒定表明，從恢復(fù)系親本1951