甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育基因與恢復(fù)基因的精細(xì)定位.pdf

1、Rs1046AB是派生于宜3A的純合型甘藍(lán)型油菜顯性細(xì)胞核雄性不育系，具有敗育徹底、不育性穩(wěn)定和恢復(fù)源廣泛等特點(diǎn)。1985年，李樹(shù)林等經(jīng)過(guò)大量的遺傳分析后，提出甘藍(lán)型油菜顯性核不育材料宜3A的育性受兩對(duì)顯性基因互作控制的遺傳假說(shuō)，其中一對(duì)為顯性不育基因，另一對(duì)為顯性上位抑制基因，當(dāng)顯性不育基因單獨(dú)表達(dá)時(shí)可以導(dǎo)致雄性不育，而當(dāng)顯性上位抑制基因存在時(shí)，育性又可以恢復(fù)正常。最近宋來(lái)強(qiáng)等（2006）通過(guò)遺傳分析表明利用一對(duì)復(fù)等位基因控制的模式來(lái)

2、解釋Rs1046AB的遺傳更加合理，即Ms為顯性不育基因，Mf為等位顯性恢復(fù)基因，ms為正常可育位點(diǎn)，并且具有Mf>Ms>ms的顯性遺傳效應(yīng)。以Rs1046AB為主要材料，洪登峰（2006）已利用一個(gè)192株的F2群體對(duì)Rs1046AB的不育基因和恢復(fù)基因進(jìn)行了初步定位。以此為基礎(chǔ)，本研究中通過(guò)不育系Rs1046A和恢復(fù)系195-14A（溫敏型細(xì)胞質(zhì)雄性不育兩用系）雜交構(gòu)建F2：3家系和F2全不育株群體，利用分子標(biāo)記技術(shù)篩選與不育基因M

3、s和恢復(fù)基因Mf連鎖的分子標(biāo)記，進(jìn)一步開(kāi)展顯性核不育基因與恢復(fù)基因（Ms/Mf）的精細(xì)定位研究，取得的主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1．將3個(gè)AFLP標(biāo)記E3M10、E1M13和S5T5（洪登峰，2006）成功轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記（依次命名為：SCD2、SCD7和SCD8）。，并結(jié)合SCAR標(biāo)記SCE3（陸光遠(yuǎn)，2003）和SCHDF（洪登峰，2006），進(jìn)一步分析708個(gè)單株構(gòu)成的F2：3家系和987個(gè)單株的F2全不育株群體，結(jié)果

4、表明：SCD2、SCE3、SCD7和SCD84個(gè)SCAR標(biāo)記全部位于目標(biāo)基因一側(cè)，距目標(biāo)基因（Ms/Mf）的遺傳距離依次為2.0cM、1.7cM、1.5cM、0.1cM，另外一個(gè)SCAR標(biāo)記SCHDF位于目標(biāo)基因的另一側(cè)，且距目標(biāo)基因的遺傳距離為2.3cM，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因的準(zhǔn)確定位。
　　 2．應(yīng)用BSA法，結(jié)合AFLP技術(shù)，繼續(xù)篩選了512對(duì)AFLP的引物組合，獲得了4個(gè)與目標(biāo)基因緊密連鎖的AFLP標(biāo)記。其中2個(gè)標(biāo)記（P1M

5、1、P1M4）為共顯性標(biāo)記，被定位于SCAR標(biāo)記SCD7與SCD8之間。另外2個(gè)標(biāo)記（P3M2、P12M6）為顯性標(biāo)記，與恢復(fù)基因連鎖，分別位于目標(biāo)基因兩側(cè)，前者被定位于SCAR標(biāo)記SCD7和SCD8之間，后者被定位于標(biāo)記SCHDF與目標(biāo)基因之間，使目標(biāo)基因的遺傳距離進(jìn)一步縮小。
　　 3．通過(guò)比較測(cè)序，將Song et al．，（2006）在甘藍(lán)型油菜顯性核不育系609AB中獲得的不育基因兩側(cè)最近的SCAR標(biāo)記SC6和SC9進(jìn)

6、行整合，并成功轉(zhuǎn)化為既與不育基因連鎖又與恢復(fù)基因連鎖的SCAR標(biāo)記，重新被命名為SC6D和SC9H。前者被定位于AFLP標(biāo)記P12M6與目標(biāo)基因之間，后者被定位于AFLP標(biāo)記P3M2和P1M1/P1M4之間，且分別距目標(biāo)基因的遺傳距離均為1.0cM。結(jié)合上述AFLP標(biāo)記和SCAR標(biāo)記，在本研究中實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)基因（Ms/Mf）的精細(xì)遺傳定位。
　　 4．利用DH群體TN（Tapidor×Ningyou7）的遺傳圖譜將目標(biāo)基因Ms/

7、Mf定位于甘藍(lán)型油菜的N8連鎖群，并在N8連鎖群上成功開(kāi)發(fā)出一個(gè)與Ms/Mf基因連鎖的共顯性SSR標(biāo)記HUA348，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)基因精細(xì)定位圖譜與已公布的甘藍(lán)型油菜圖譜的整合。
　　 5．根據(jù)目標(biāo)基因區(qū)段與對(duì)應(yīng)擬南芥同源區(qū)的信息（洪登峰，2006），在目標(biāo)基因兩側(cè)標(biāo)記之間，設(shè)計(jì)18對(duì)特異引物（DFN1-DFN18）對(duì)目標(biāo)區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果除了DFN03、DFN12、DNA14和DFN18等4對(duì)引物外，其余14對(duì)引物都同時(shí)擴(kuò)增出不育

8、基因和恢復(fù)基因，對(duì)這14對(duì)引物進(jìn)行比較測(cè)序分析之后再次設(shè)計(jì)引物，結(jié)果仍然沒(méi)有開(kāi)發(fā)出新的分子標(biāo)記。
　　 6．以與目標(biāo)基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記SCD8為探針進(jìn)行Southern雜交，篩選甘藍(lán)型油菜Tapidor BAC文庫(kù)，獲得了29個(gè)具有強(qiáng)雜交信號(hào)的BAC克隆。
　　 7．利用DFN1、DFN5、DFN8、DFN16和SCD8共5對(duì)引物通過(guò)PCR分析的方法對(duì)所獲得的29個(gè)BAC克隆進(jìn)行陽(yáng)性驗(yàn)證，結(jié)果依據(jù)其中的18個(gè)克隆