“磁場-PST磁性納米微?！斌w系對雪旺細胞定向遷移的作用研究.pdf

1、脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）往往造成嚴重的后果，患者往往伴隨終身的功能障礙，為社會及家庭地帶來沉重的負擔。因此，促進脊髓損傷后的神經修復，提高功能恢復水平，顯得迫切且必要。細胞移植對于脊髓損傷后的功能恢復具有顯著的作用。雪旺細胞（Schwann cell，SC）是外周神經系統（Peripheral nerve injury，PNI）的成髓鞘細胞，對于神經的再生與修復具有明確且顯著的作用；雪旺細胞能夠分泌多種促

2、進并維持神經軸突生長的神經營養(yǎng)因子以及對再生軸突具有引導作用的支持基質，同時，雪旺細胞還能夠再髓鞘包裹、保護再生的神經軸突以及脫髓鞘的神經軸突，為再生的神經軸突“搭橋鋪路”，引導其延伸進入脊髓損傷遠端，進而促進功能的恢復；因此，雪旺細胞是最具有臨床應用前景的治療脊髓損傷的種子細胞之一。
　　雪旺細胞移植治療脊髓損傷仍然還有很多局限性限制了療效的進一步提高。雪旺細胞移植到中樞神經系統（Central nervous system，C

3、NS）后，細胞的遷移能力受到極大限制，宿主星形膠質細胞包裹雪旺細胞，二者形成明顯的細胞邊界，無法實現引導再生神經軸突的修復作用，與星形膠質細胞形成的邊界也阻礙了再生軸突的長入。
　　采用基因修飾的辦法將多聚唾液酸轉移酶（Polysialyltransferase，PST）轉染進入雪旺細胞，誘導細胞過表達唾液酸化的神經細胞粘附分子(Polysialylation of neural cell adhesion molecule，PS

4、A-NCAM)，提高細胞的遷移能力，動物實驗證實脊髓損傷部位再生軸突增多，功能恢復水平提高。因此，我們設想，利用SPIONs將PST磁轉染進入雪旺細胞，一方面，PST表達上調可增強雪旺細胞的遷移能力，另一方面，通過施加外部磁場對細胞施加定向牽引力，引導雪旺細胞的定向遷移。通過上述策略，增強雪旺細胞的定向遷移能力，以提高雪旺細胞移植治療脊髓損傷的療效。
　　第一部分、磁性納米微粒的物理特性及其對雪旺細胞生物活性的影響
　　目的

5、：明確磁性納米微粒的物理形態(tài)及表面電勢，入胞后在細胞內的分布形態(tài)；明確PEI-SPIONs磁轉染雪旺細胞的細胞毒性，篩選最佳轉染濃度。
　　方法：利用透射電子顯微鏡測量 PEI-SPIONs的粒徑并觀察其分布形態(tài)，利用Zeta電勢/粒徑測量儀分布測量PEI-SPIONs及PEI-SPIONs/PST復合物的粒徑及表面電勢；利用CCK-8試劑盒及細胞活-死染色試劑盒明確不同濃度PEI-SPIONs磁轉染雪旺細胞后的細胞活性及死亡細胞

6、比率。
　　結果：透射電子顯微鏡發(fā)現：PEI-SPIONs的平均粒徑為28.2?3.6nm，PEI-SPIONs的磁飽和度在3.382Oe時為61.62emu/g，Zeta電勢/粒徑測量儀測得PEI-SPIONs粒徑為186.5?23.4nm，表面電勢為19.20?3.2mV；測得PEI-SPIONs/PST復合物的平均粒徑為378.8?109.1nm，表面電勢為17.51?2.4mV。磁轉染24h后，PEI-SPIONs磁轉染濃

7、度低于4μg/μL時，死細胞的比例為3.01％-5.26%，當磁轉染后72h時，死亡細胞比例與磁轉染后24h相比無統計學差異；磁轉染濃度為8μg/μL時，轉染24h及72h后死亡細胞比例分別增加至6.41%±1.03%和6.63%±1.16%；CCK-8試劑盒分析細胞活性，磁轉染后24h及72h，轉染濃度0μg/μL，1μg/μL，2μg/μL，4μg/μL之間，細胞活性無統計學差異，當轉染濃度提高至8μg/μL時，磁轉染后24h及72

8、h細胞活性分別下降19.23%和22.41%。
　　結論：PEI-SPIONs及PEI-SPIONs/PST復合物的陽性表面電勢更適于細胞吞入；在磁轉染PEI-SPIONs濃度?8μg/μL時，對細胞的毒性較小；透射電子顯微鏡及Zeta電勢/粒徑測量儀所測得的粒徑差異可能歸因于Zeta電勢/粒徑測量儀標本時，表面帶電荷的PEI-SPIONs發(fā)生的聚集現象。
　　第二部分：PST磁性納米微粒轉染雪旺細胞對PSA-NCAM表達的

9、影響
　　目的：確定PEI-SPIONs/PST磁轉染雪旺細胞對細胞內PSA-NCAM表達的影響。
　　方法：利用掃描電子顯微鏡觀察磁轉染后雪旺細胞形態(tài)以及PEI-SPIONs貼附至細胞膜的形態(tài)及分布，利用透射電子顯微鏡觀察磁轉染后PEI-SPIONs在雪旺細胞細胞內的分布形態(tài)；利用 PCR測定不同PEI-SPIONs轉染濃度及不同質量比PEI-SPIONs/PST磁轉染細胞后對PST mRNA水平的影響，Western b

10、lot檢測磁轉染后雪旺細胞內PSA-NCAM的蛋白表達水平，利用免疫熒光染色特異性標記PSA-NCAM，觀察PEI-SPIONs/PST磁轉染雪旺細胞后PSA-NCAM的表達水平。
　　結果：磁轉染6h后，掃描電子顯微鏡可以觀察到細胞膜上有顆粒狀物，而在未轉染的細胞膜上沒有觀察到；磁轉染后24h，在雪旺細胞之內能夠觀察到一簇顆粒狀物，表明了PEI-SPIONs已經貼附到細胞膜上通過內吞作用轉移到了細胞質內；PCR結果表明，隨著PE

11、I-SPIONs轉染濃度從1μg/mL上升至4μg/mL，PST的mRNA水平也明顯的增高；另外，隨著PEI-SPIONs/PST的質量比從1:2提高至1:4，PST的mRNA水平在PEI-SPIONs濃度1μg/mL時上升了2.20倍，2μg/mL時上升了20.11倍，4μg/mL時上升了1.89倍。在PEI-SPIONs轉染濃度4μg/mL，PEI-SPIONs/PST質量比1:4時，PST的mRNA水平是正常對照組的1041倍；W

12、estern blot結果顯示，PEI-SPIONs/PST磁轉染組的 PSA-NCAM蛋白表達水平明顯增高，但在對照組中僅僅檢測到了很少的表達；PEI-SPIONs/PST磁轉染組雪旺細胞特異性 PSA-NCAM染色顯示表達水平很高，而在對照組幾乎沒有PSA-NCAM特異性染色標記。
　　結論：通過PCR檢測PST的mRNA水平以及Western blot和免疫熒光染色測定細胞 PSA-NCAM的表達水平，我們可以看出 PST磁

13、轉染雪旺細胞在細胞內成功表達，并且誘導了細胞PSA-NCAM的高表達。首次成功使用磁轉染技術成功轉染雪旺細胞并誘導了PSA-NCAM的高表達。
　　第三部分：外部磁場對PST磁轉染后雪旺細胞遷移及定向能力的影響
　　目的：探索外部磁場對磁轉染后雪旺細胞在星形膠質細胞環(huán)境中的遷移及定向能力的影響。
　　方法：利用雪旺細胞在星形膠質細胞層上的遷移實驗測試雪旺細胞的遷移能力，測量遷出雪旺細胞的最大遷移距離，平均遷移距離，遷出

14、細胞數量以及遷出雪旺細胞的定向指數；利用雪旺細胞與星形膠質細胞分區(qū)共培養(yǎng)實驗，測試雪旺細胞能否穿越星形膠質細胞邊界，進入星形膠質細胞區(qū)域，測量遷入星形膠質細胞區(qū)域的雪旺細胞數目以及遷入的平均距離。
　　結果：當PST磁轉染雪旺細胞時，在外部磁場作用下，細胞在星形膠質細胞層上的遷移能力被更進一步增強，并且細胞的遷移方向規(guī)律地沿著外部磁場的方向排列；PST磁轉染雪旺細胞在有外部磁場時（56.8?9.72/500?m，p?0.05），在

15、特定距離玻片邊緣的遷出數量明顯多于無磁場時（46.3?6.47/500?m，p?0.05）。在有外部磁場時，PEI-SPIONs/PST/SC以及PEI-SPIONs/DNA/SC實驗組的雪旺細胞均能打破與星形膠質細胞的細胞邊界并且沿著外部磁場方向規(guī)律排列；但PEI-SPIONs/PST/SC遷移進入星形膠質細胞區(qū)域的細胞數量是PEI-SPIONs/DNA/SC的1.85倍（p?0.05）。
　　結論：PST磁轉染后雪旺細胞使細胞