正二十八烷醇抗炎作用的機(jī)理研究.pdf

1、二十八烷醇(n-octacosanol)是一種具有眾多生理功能的一元高級(jí)飽和直鏈脂肪醇(CH3(CH2)26CH20H)，主要以蠟酯形式存在于米糠、甘蔗等天然植物中。由于我國(guó)稻谷產(chǎn)量豐富，因此研究從米糠中提取的活性成分二十八烷醇的生理功能及分子機(jī)制，對(duì)稻谷和其副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用具有重要的實(shí)際與經(jīng)濟(jì)意義。二十八烷醇化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且?guī)缀鯚o(wú)毒性。研究表明二十八烷醇具有促進(jìn)新陳代謝，抗疲勞，保護(hù)心血管等多種生理功能。近年研究發(fā)現(xiàn)二十八烷醇還表現(xiàn)出抗

2、炎活性，其抗炎功能分子機(jī)制尚不明確。本文利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，以及葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎癥模型，來(lái)探究二十八烷醇抗炎功效及其分子機(jī)理。二十八烷醇對(duì)結(jié)腸炎癥小鼠宏觀(guān)表型、組織損傷的影響。本文利用3.0％ DSS水溶液，ICR小鼠連續(xù)自由飲用11d，建立結(jié)腸炎癥模型。飲用DSS水溶液之前，保護(hù)組小鼠提前2天灌胃二十八烷醇混懸液（100 mg/kg/day）。DSS損傷組小鼠出現(xiàn)體重下降、懶

3、動(dòng)、嗜睡、毛發(fā)光澤度下降及肉眼可見(jiàn)便血等現(xiàn)象，疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）不斷升高。其結(jié)腸組織發(fā)生潰瘍、充血、水腫等癥狀，腸壁增厚，長(zhǎng)度縮短，重量增加、脾臟增大。保護(hù)組小鼠精神狀態(tài)有所改善，肉眼可見(jiàn)少量便血或無(wú)便血，DAI評(píng)分顯著降低。結(jié)直腸發(fā)生潰瘍、水腫程度減輕，腸壁增厚，腸重增大、長(zhǎng)度萎縮較損傷組有所減少。制作HE染色結(jié)腸組織切片，顯微鏡下可觀(guān)察到:與正常組相比，損傷組小鼠結(jié)腸呈現(xiàn)出顯著的急性炎癥反應(yīng)癥狀:黏膜大面積糜爛、潰瘍，腺體的隱窩

4、結(jié)構(gòu)被破壞，淋巴細(xì)胞及伴中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞丟失;保護(hù)組小鼠只有少量出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜和隱窩結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，排列比較整齊。
　　二十八烷醇對(duì)結(jié)腸炎癥小鼠生化指標(biāo)含量的影響。利用試劑盒，檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA和炎癥介質(zhì)NO的含量。測(cè)得損傷組小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA和NO含量分別升高為對(duì)照組的2.9倍、3.1倍與3.8倍，差異顯著;與損傷組對(duì)比，二十八烷醇保護(hù)組小鼠結(jié)腸組織中MPO、MDA和NO含量分別

5、降低為其0.65、0.59和0.65倍，差異顯著。
　　二十八烷醇對(duì)結(jié)腸炎癥小鼠炎癥因子表達(dá)的影響。分別利用實(shí)時(shí)熒光定量real-time PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)結(jié)腸組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，損傷組小鼠結(jié)腸組織中四種炎癥因子mRNA表達(dá)量分別升高7.51、6.16、12.95和16.54倍，

6、差異顯著;而與損傷組比較，二十八烷醇組小鼠中四種mRNA表達(dá)量分別降低為其0.61、0.45、0.25和0.61倍，差異顯著。損傷組小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的蛋白表達(dá)量分別升高為對(duì)照組的4.44、2.73、4.54和5.00倍。而二十八烷醇保護(hù)組四種蛋白分別降低為損傷組的0.75、0.63、0.78和0.80倍，差異顯著。二十八烷醇可使小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子表達(dá)量顯著減少。
　　本實(shí)驗(yàn)利用1

7、.0μg/mL LPS溶液誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，設(shè)置對(duì)照，LPS誘導(dǎo)，LPS+10μg/mL、30μg/mL和100μg/mL二十八烷醇干預(yù)組五組細(xì)胞。二十八烷醇對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞毒性影響。將細(xì)胞置于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，各組細(xì)胞數(shù)量排列密集，形狀呈梭狀，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞狀態(tài)無(wú)明顯差異。采用MTS法檢測(cè)二十八烷醇對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性的影響。對(duì)照組、二十八烷醇組OD值之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。說(shuō)明10～

8、100μg/mL二十八烷醇溶液對(duì)RAW264.7細(xì)胞無(wú)毒性，對(duì)其生長(zhǎng)、狀態(tài)及活性無(wú)影響，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。二十八烷醇對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。分別采用RT-qPCR和Western blot比較各組細(xì)胞炎癥基因表達(dá)差異。LPS組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎癥因子mRNA表達(dá)量升高為對(duì)照組的5.66、7.59、6.78和2.62倍;與LPS組細(xì)胞表達(dá)量比較，10μg/mL、30μg/mL和1

9、00μg/mL三組二十八烷醇保護(hù)組細(xì)胞中四種炎癥因子mRNA表達(dá)量均顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性。LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS炎癥因子蛋白表達(dá)量分別為對(duì)照組細(xì)胞的4.31、4.80、6.25和4.29倍。與LPS組細(xì)胞比較，三組二十八烷醇保護(hù)組細(xì)胞中四種蛋白表達(dá)量顯著降低，且呈劑量依賴(lài)性。二十八烷醇可顯著降低細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平。
　　二十八烷醇對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κ

10、B/p65)和(AP-1/c-Jun)轉(zhuǎn)錄活性的影響。分別利用熒光素酶報(bào)告基因和Western blot技術(shù)，研究轉(zhuǎn)錄因子活性和其核移位作用。與對(duì)照組相比，LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞AP-1與NF-κB相對(duì)熒光素酶活性(RLU)顯著升高，分別為對(duì)照組細(xì)胞RLU3.41和2.49倍;而二十八烷醇組細(xì)胞中RLU值顯著減少，呈劑量依賴(lài)性。LPS組細(xì)胞細(xì)胞核中c-Jun和p65蛋白表達(dá)量分別增加2.17、1.56倍;而細(xì)胞漿中c-Jun和p65蛋白表達(dá)量

11、分別為其0.53、0.41倍。與LPS組細(xì)胞比較，二十八烷醇組細(xì)胞中，細(xì)胞核c-Jun和p65蛋白表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞漿中兩種蛋白表達(dá)量明顯升高，且呈劑量依賴(lài)性。因此，二十八烷醇可顯著抑制炎癥細(xì)胞p65與c-Jun的核移位作用，降低AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。
　　二十八烷醇對(duì)RAW264.7細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路關(guān)鍵靶分子的磷酸化作用:LPS誘導(dǎo)組細(xì)胞中p38、c-Jun氨基末端激酶（JNK）與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白

12、激酶1/2(ERK1/2)磷酸化作用顯著升高，分別為對(duì)照組細(xì)胞3.80、2.23和2.56倍。與LPS組細(xì)胞比較，二十八烷醇組三組細(xì)胞中p38、JNK磷酸化水平顯著減少，且呈劑量依賴(lài)性。100μg/mL二十八烷醇組細(xì)胞p-ERK1/2表達(dá)顯著減少。說(shuō)明LPS可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中p38、ERK和JNK磷酸化，而二十八烷醇可顯著抑制其磷酸化的激活。
　　使用MAPK抑制劑處理RAW264.7細(xì)胞，利用Western blot及

13、熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)分析了各組細(xì)胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)量，p38、JNK及ERK1/2的磷酸化水平，以及其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。結(jié)果顯示，與LPS誘導(dǎo)組相比，抑制劑組細(xì)胞中TNF-α、IL-1β表達(dá)量，以及p38、JNK及ERK1/2磷酸化蛋白表達(dá)水平顯著減少，AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的活性降低。在二十八烷醇與抑制劑共同作用下，炎癥因子含量、MAPK磷酸化水平與轉(zhuǎn)錄因子活性進(jìn)一步降低。說(shuō)明MAPK磷酸化作用可使轉(zhuǎn)錄因

14、子活性增強(qiáng)，炎癥因子表達(dá)增多。二十八烷醇通過(guò)阻斷MAPK通路，發(fā)揮抗炎功效。
　　綜上，在動(dòng)物整體水平，二十八烷醇能夠顯著改善DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥小鼠宏觀(guān)表型，降低DAI，減輕結(jié)腸組織病理?yè)p傷;減少結(jié)腸組織中MPO、MDA和NO含量;抑制結(jié)腸組織炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的過(guò)表達(dá)。細(xì)胞水平，二十八烷醇可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因的過(guò)表達(dá);抑制