揚(yáng)子鱷源普通變形桿菌生物被膜特性及形成相關(guān)基因研究.pdf

1、普通變形桿菌（Proteus vulgaris）是一種重要的條件致病菌，廣泛分布于自然界和爬行動(dòng)物、鳥類、哺乳動(dòng)物等腸道，對(duì)人類健康和養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重大潛在危害，在一定條件下，可引起宿主發(fā)病甚至致死。普通變形桿菌是變形桿菌屬中具有重要致病意義的病原之一，可引起敗血癥、泌尿道系統(tǒng)結(jié)石、痛風(fēng)、慢性中耳炎、創(chuàng)傷感染等，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等，是醫(yī)院交叉感染的主要病原。近年來(lái)，有關(guān)變形桿菌致病的報(bào)道逐漸增多。
　　在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)

2、展過(guò)程中，抗生素的使用，曾對(duì)控制細(xì)菌性疾病，促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展起到了重要作用，但隨之而來(lái)的問(wèn)題也逐漸突顯。在使用抗生素控制某一細(xì)菌疾病同時(shí)，經(jīng)過(guò)抗生素篩選，宿主體內(nèi)的其他條件性致病菌耐藥性逐漸增強(qiáng)。細(xì)菌耐藥現(xiàn)象已成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)。此外，病原要想對(duì)宿主致病，首先必須能夠在宿主體內(nèi)定殖并逃避各種機(jī)體防御系統(tǒng)。吞噬細(xì)胞作為機(jī)體重要防御屏障，可吞噬進(jìn)入機(jī)體的病原，對(duì)其清除具有重要意義。細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm，BF)作為細(xì)

3、菌重要耐藥機(jī)制之一，廣泛存在于自然界，具有極強(qiáng)的耐藥性及免疫逃避性，是造成臨床慢性感染主要原因之一。
　　本試驗(yàn)從安徽省揚(yáng)子鱷繁殖研究中心發(fā)病和死亡揚(yáng)子鱷體內(nèi)分離到18株普通變形桿菌。對(duì)分離的18株普通變形桿菌進(jìn)行了生物被膜形成能力及特性分析，結(jié)果表明，其中14株具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，3株具有中等的生物被膜形成能力，僅有1株形成生物被膜的能力較弱，占比分別為77.8％，16.7％和5.5％。
　　在具有較強(qiáng)生物被膜形成

4、能力的14株菌中，選取一株對(duì)卡那霉素敏感的強(qiáng)生物被膜菌株P(guān)roteus vulgaris XC2，作為轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變的受體菌。為方便后續(xù)試驗(yàn)，我們對(duì)受試菌株生物被膜形成條件進(jìn)行優(yōu)化，確定其生物被膜最適形成條件為在含有0.2％葡萄糖或蔗糖為碳源的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。在進(jìn)行轉(zhuǎn)座突變前，對(duì)Proteus vulgaris XC2菌株生物被膜態(tài)和浮游態(tài)（planktonic）體外條件下的抗RAW264.7吞噬細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)行

5、了分析，結(jié)果顯示RAW264.7細(xì)胞對(duì)2者具有相同的吞噬能力。
　　用含PUT mini Tn5轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的大腸桿菌與Proteus vulgaris XC2進(jìn)行三親結(jié)合，經(jīng)篩選傳代后，共獲得500個(gè)轉(zhuǎn)座結(jié)合子的突變庫(kù)。采用結(jié)晶紫法，對(duì)各菌株生物被膜進(jìn)行定量試驗(yàn)，結(jié)果共獲得3株生物被膜缺陷株。其中，一株經(jīng)傳代死亡。對(duì)剩下的兩株利用TAIL-PCR技術(shù)擴(kuò)增插入片段側(cè)翼序列。最終，經(jīng)擴(kuò)增，測(cè)序，比對(duì)，明確一株生物被膜缺陷株失活基因?yàn)間l