骨形態(tài)發(fā)生蛋白4促進(jìn)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞分化及其機(jī)制研究.pdf

1、竇房結(jié)是位于上腔靜脈與右心耳交界處天然起搏點(diǎn)。隨著人口老齡化加劇，SAN病變所致的心源性暈厥和猝死發(fā)病率逐年增加。闡明胚胎心臟發(fā)育過(guò)程中調(diào)控SAN起搏細(xì)胞的分化發(fā)育網(wǎng)絡(luò)及各胚胎發(fā)育因子在其中所扮演的角色對(duì)構(gòu)建適應(yīng)生理需要的生物起搏具有重大意義。心外膜祖細(xì)胞具有向成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、竇房結(jié)起搏細(xì)胞等心系細(xì)胞分化的潛能性，大部分心外膜祖細(xì)胞表達(dá)Tbx18轉(zhuǎn)錄因子。Tbx18缺失導(dǎo)致竇房結(jié)頭部結(jié)構(gòu)嚴(yán)重缺失。因此，Tbx18+心外膜祖細(xì)

2、胞可能是構(gòu)建生物起搏器最值得研究的種子細(xì)胞之一。在胚鼠成纖維細(xì)胞向心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的直接基因重組探索實(shí)驗(yàn)中，增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）因子可將有規(guī)律自發(fā)起搏功能的心肌轉(zhuǎn)化率提高近150倍。因此，明確BMP4對(duì)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞分化的作用及其作用機(jī)制具有重要價(jià)值。本研究通過(guò)構(gòu)建Tbx18-Cre/Rosa26REYFP體外譜系示蹤模型，探索BMP4對(duì)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞分化的作用及調(diào)控機(jī)制。
　　第一

3、部分、Tbx18-Cre和YFP轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖與鑒定
　　目的：分別繁殖、鑒定出攜帶Tbx18-Cre轉(zhuǎn)基因雌性小鼠和條件性Cre報(bào)告雄性小鼠Rosa26REYFP并將兩種轉(zhuǎn)基因小鼠用于交配建立基于雙雜合小鼠的譜系示蹤模型，為下一步示蹤胚胎心臟Tbx18+細(xì)胞的分化命運(yùn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：將Tbx18-Cre和Rosa26REYFP轉(zhuǎn)基因雄鼠分別與育齡期C57BL/6雌鼠進(jìn)行交配、繁殖，應(yīng)用“一管酒精基因組抽提法”提

4、取基因組，PCR鑒定子代基因型。
　　結(jié)果：成功篩選、鑒定攜帶Tbx18-Cre轉(zhuǎn)基因雌性小鼠和條件性Cre報(bào)告雄性小鼠Rosa26REYFP。
　　結(jié)論：建立了簡(jiǎn)捷、高效率的大樣本基因組篩選技術(shù)平臺(tái)，成功繁殖Tbx18-Cre轉(zhuǎn)基因雌性小鼠和Rosa26REYFP雄性小鼠，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
　　第二部分、建立Tbx18+心外膜祖細(xì)胞譜系示蹤模型
　　目的：培養(yǎng)出純度高、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的E11.5天心外膜

5、祖細(xì)胞，建立Tbx18+心外膜祖細(xì)胞譜系示蹤模型。
　　方法：通過(guò)Tbx18-Cre雌鼠和Rosa26REYFP雄鼠交配，取E11.5天胚胎心臟進(jìn)行貼片培養(yǎng)，胎鼠組織用于PCR鑒定基因型，心臟外層細(xì)胞爬出后顯微鏡下篩選Tbx18+心外膜祖細(xì)胞。
　　結(jié)果：熒光篩選法可簡(jiǎn)便、有效篩選出Tbx18+示蹤心外膜祖細(xì)胞。超過(guò)95%的E11.5天胚胎心外膜祖細(xì)胞是Tbx18陽(yáng)性細(xì)胞。
　　結(jié)論：通過(guò)Tbx18-Cre/Rosa2

6、6REYFP雙轉(zhuǎn)基因雜合小鼠模型，建立Tbx18+心外膜祖細(xì)胞譜系示蹤模型，可示蹤Tbx18+心外膜祖細(xì)胞的分化命運(yùn)。
　　第三部分、BMP4促進(jìn)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞分化為起搏細(xì)胞
　　目的：探索BMP4是否調(diào)控Tbx18+EPCs向起搏細(xì)胞分化。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為BMP4組、BMP4+LDN193189組、空白對(duì)照組、LDN193189組進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)免疫熒光和熒光定量PCR法分別檢測(cè)起搏細(xì)胞標(biāo)志物HCN4的表

7、達(dá)。
　　結(jié)果：BMP4干預(yù)促進(jìn)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞HCN4表達(dá)上調(diào)，隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，HCN4表達(dá)增多。
　　結(jié)論：BMP4促進(jìn)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞分化為起搏細(xì)胞。
　　第四部分、BMP4調(diào)控Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞定向分化的機(jī)制研究
　　目的：探索BMP4促進(jìn)Tbx18+心外膜祖細(xì)胞向起搏細(xì)胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為BMP4組、BMP4+LDN193189組、空白對(duì)照組、LD

8、N193189組進(jìn)行干預(yù)，熒光定量PCR法檢測(cè)BMP4、SHOX2、Tbx3、GATA4、Nkx2.5基因轉(zhuǎn)錄水平，篩選出BMP4的作用靶點(diǎn)，行免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步通過(guò)RNAi技術(shù)抑制BMP4下游靶點(diǎn)，分為BMP4組,BMP4+GATA4-RNAi組，空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組，GATA4-RNAi組，檢測(cè)GATA4、BMP4、HCN4、Nkx2.5，明確上下游關(guān)系。
　　結(jié)果：熒光定量PCR顯示，BMP4上調(diào)GATA4m

9、RNA表達(dá)、下調(diào)Nkx2.5mRNA表達(dá)，對(duì)SHOX2、Tbx3、BMP4表達(dá)無(wú)影響。免疫熒光檢測(cè)提示BMP4上調(diào)GATA4表達(dá)、下調(diào)Nkx2.5mRNA表達(dá)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)BMP4表達(dá)無(wú)影響。熒光定量PCR和免疫熒光觀察到，RNAi有效下調(diào)GATA4的表達(dá)，GATA4-RNAi干預(yù)使HCN4下調(diào)、Nkx2.5上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)BMP4表達(dá)無(wú)改變。
　　結(jié)論：BMP4通過(guò)上調(diào)GATA4促進(jìn)Tbx18+EPCs向起搏細(xì)胞分化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Nkx2.