基于解旋酶酶促信號擴(kuò)增的氧化石墨烯生物傳感平臺檢測microRNA的研究.pdf

1、目前，分子診斷生物學(xué)研究正不斷地對人類疾病診斷產(chǎn)生變革性的影響，它可以幫助醫(yī)生更好地了解每個(gè)病人的臨床狀況，如當(dāng)前疾病狀態(tài)、預(yù)測疾病狀態(tài)、藥物反應(yīng)和治療預(yù)后。分子診斷的本質(zhì)在于靈敏檢測疾病生物標(biāo)志物，如蛋白質(zhì)、碳水化合物或核酸。MicroRNAs(miRs)作為一組內(nèi)源性非編碼RNA（18-25核苷酸），在多種疾病細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要的作用。值得注意的是，miRs的頻繁異常表達(dá)將這些小細(xì)胞分子成分加入到癌癥的潛在生物標(biāo)志物行列。因此，敏

2、感和有效的檢測方法對于更好地理解這些相對較小的核酸分子和進(jìn)一步驗(yàn)證其在臨床分子診斷中的功能具有重要的意義。然而，由于它們具有小尺寸和高度同源等特性，敏感和經(jīng)濟(jì)的miRs檢測方法仍然具有很大的挑戰(zhàn)性。
　　近年來，各種以檢測靈敏度和特異性為研究重點(diǎn)的新方法處于不斷開發(fā)中，如納米顆粒復(fù)合探針、等溫?cái)U(kuò)增方法和電化學(xué)方法等。其中，大部分等溫?cái)U(kuò)增方法所依靠的鏈置換、鏈雜交和鏈延伸等循環(huán)擴(kuò)增原理都與核酸酶密切相關(guān)，如聚合酶、核酸內(nèi)切酶或切口酶

3、、雙鏈特異性核酸酶等。解旋酶是一類重要的核酸酶，它可以利用ATP水解的能量沿著核酸磷酸骨架定向移動，分離兩條退火的核酸鏈（即DNA鏈、RNA鏈或RNA-DNA雜交鏈）。解旋酶對核酸分子探針內(nèi)氫鍵的水解活性，使其在相應(yīng)的分子診斷系統(tǒng)中具有巨大的潛在應(yīng)用性，特別是以雜交反應(yīng)為檢測原理的傳感系統(tǒng)。
　　本文通過pET24a-RecQE重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)獲得大腸桿菌RecQ解旋酶（RecQE），系統(tǒng)研究了RecQE在不同miR氧化石墨烯（G

4、O）傳感平臺中的作用機(jī)理以及酶學(xué)活性。分析了RecQE在以1:1雜交反應(yīng)以及雜交鏈反應(yīng)（HCR）為檢測原理的傳感平臺中的分子作用機(jī)制，構(gòu)建了RecQE輔助GO傳感平臺和高靈敏RecQE酶促HCR/GO傳感平臺，并對這兩個(gè)傳感平臺做了進(jìn)一步的研究，主要內(nèi)容如下：
　　(1)開發(fā)了一種以1:1雜交反應(yīng)為檢測原理的RecQE酶輔助GO傳感平臺，用于系統(tǒng)的研究解旋酶對傳感平臺中雜交反應(yīng)的分子作用機(jī)制。此傳感平臺通過簡單的DNA/RNA雜交

5、反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)DNA探針（FDNA）所標(biāo)記熒光基團(tuán)在 GO表面的熒光猝滅與恢復(fù)，通過熒光信號的變化直觀地分析RecQE對雜交反應(yīng)的分子作用機(jī)制。RecQE參與的檢測系統(tǒng)熒光信號強(qiáng)度增強(qiáng)高達(dá)22.56％，這表明RecQE對GO表面的雜交反應(yīng)具有明顯的促進(jìn)作用。RecQE酶輔GO傳感平臺檢測let-7a的靈敏度實(shí)驗(yàn)與特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，此傳感平臺能夠高特異性的區(qū)分各種堿基錯(cuò)配的miRs并能準(zhǔn)確檢測系統(tǒng)相對應(yīng)的靶目標(biāo)，能夠靈敏的定量檢測miR至

6、0.18 nM。這說明，此 GO傳感平臺并沒有因 RecQE的引入而影響其檢測靈敏度以及特異性，驗(yàn)證了RecQE對此GO傳感平臺的優(yōu)良兼容性。此外，F(xiàn)DNA與阻斷DNA (BDNA)組成的FDNA-BDNA復(fù)合探針可以有效阻止RecQE以及其他小分子蛋白與FDNA的非特異性結(jié)合，降低外界干擾所引起的系統(tǒng)背景熒光強(qiáng)度變化。
　　(2)利用RecQE在FDNA-BDNA-GO傳感平臺當(dāng)中的作用機(jī)理，進(jìn)一步開發(fā)了一種基于Rec

7、QE酶促雜交鏈反應(yīng)（HCR）信號擴(kuò)增的靈敏檢測 miR的 GO傳感平臺。相比于無酶 HCR/GO傳感平臺，RecQE酶促HCR/GO傳感平臺熒光信號強(qiáng)度表現(xiàn)出高達(dá)244.3％信號增強(qiáng)，并將檢測時(shí)間從4 h縮短至50 min。條件優(yōu)化后的RecQE酶促 HCR/GO傳感平臺應(yīng)用于檢測靶目標(biāo) let-7a的靈敏度實(shí)驗(yàn)與特異性實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，結(jié)果表明此傳感平臺對10 fM到2000 fM之間的目標(biāo)let-7a具有良好的檢測線性關(guān)系，能夠靈敏的檢測低