基于DNA酶和氧化石墨烯的高靈敏熒光生物傳感體系的研究.pdf

1、生物傳感器(Biosensor)是由生物學(xué)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)、化學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多個(gè)學(xué)科交叉融合而發(fā)展起來(lái)的一門(mén)新興而活躍的學(xué)科。近年來(lái)新的分子生物學(xué)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用中得到不斷的發(fā)展和完善，使生物分子檢測(cè)的靈敏度和特異性都得到很大的提高。然而隨著疾病診斷要求的不斷提高與科學(xué)研究的不斷深入，我們迫切需要發(fā)展一些靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)單且成本低廉的生物傳感器以便更好地滿足科學(xué)研究和實(shí)際應(yīng)用的需求。目前提高熒光傳感器靈敏度

2、的方法主要有兩類:一類是通過(guò)使用碳納米材料等超級(jí)猝滅劑提高猝滅效率以降低檢測(cè)熒光背景，另一類則是利用各種酶切催化循環(huán)放大手段提高傳感器的靈敏度。
　　 基于以上考慮，綜合文獻(xiàn)報(bào)道，本文主要采用可降低背景信號(hào)的熒光猝滅劑以及信號(hào)放大技術(shù)在提高生物傳感器的靈敏度方面做了一些工作，主要內(nèi)容如下:
　　 (1)基于DNA酶生物傳感體系的研究。DNA酶是利用體外篩選的組合生物學(xué)技術(shù)獲得的一段具有催化功能的DNA片段。在第2章中，我

3、們基于氧化石墨烯(GO)對(duì)不同長(zhǎng)度的單鏈DNA具有不同的吸附力設(shè)計(jì)了一種熒光增強(qiáng)型的DNA酶生物傳感器用于鉛離子的檢測(cè)。由于底物鏈和酶鏈的雜交探針中含有一段單鏈DNA序列，故該探針可以吸附在氧化石墨烯上，并使底物鏈5'端的熒光基團(tuán)靠近GO，從而導(dǎo)致熒光團(tuán)的熒光被猝滅。當(dāng)加入pb2+后，DNA酶的催化活性被激活，并將底物鏈切割為兩部分。含有熒光團(tuán)的短鏈DNA（5個(gè)堿基）從酶鏈上解鏈游離下來(lái)。釋放出的酶鏈可繼續(xù)與未反應(yīng)的底物鏈雜交，同時(shí)誘發(fā)

4、下一輪的催化切割，如此循環(huán)，傳感體系中就存在很多標(biāo)記有熒光團(tuán)的短鏈DNA。加入GO之后，由于短鏈DNA與氧化石墨烯結(jié)合力很弱，故熒光團(tuán)遠(yuǎn)離氧化石墨烯而使其熒光不被猝滅。該傳感器的靈敏度很高，對(duì)鉛離子的檢測(cè)限為300pM。
　　 上一章報(bào)道的DNA酶熒光傳感器對(duì)酶鏈有一定的要求，即酶鏈的環(huán)狀部分需要有一段長(zhǎng)的DNA單鏈便于雜交探針吸附在GO上。如果環(huán)狀部分的單鏈DNA太短或以雙鏈形式存在就會(huì)影響雜交探針與GO的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致傳

5、感器的背景熒光增加。因此，利用GO做熒光猝滅劑限制了上述傳感器的通用性。在第3章中，我們利用苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物的團(tuán)聚體作猝滅劑構(gòu)建了一個(gè)通用的DNA酶生物傳感平臺(tái)。苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物可以吸附于DNA酶探針上并發(fā)生團(tuán)聚，而其團(tuán)聚體可以通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移猝滅熒光團(tuán)(FAM)的熒光。鉛離子或L-組氨酸的加入使DNA酶的催化活性被激活并將底物鏈切割為兩部分，釋放出標(biāo)記有FAM的短鏈DNA、另外一段底物鏈以及DNA酶。被釋放的DNA酶可

6、繼續(xù)同未反應(yīng)的底物鏈雜交，同時(shí)誘發(fā)下一輪的催化切割。由于苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物主要吸附在酶鏈和切割后的另外一段底物鏈上，而標(biāo)記有FAM的短鏈DNA只有5個(gè)堿基，苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物很難與其結(jié)合，因此FAM的熒光未被猝滅。該傳感器具有很高的靈敏度和選擇性且通用性好，可用于檢測(cè)各種目標(biāo)物。
　　 催化信標(biāo)是當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)可以催化DNA酶水解底物鏈從而產(chǎn)生熒光信號(hào)增強(qiáng)的熒光檢測(cè)體系。一般來(lái)說(shuō)，催化信標(biāo)由標(biāo)記熒光團(tuán)的底物鏈和標(biāo)記猝滅團(tuán)

7、的DNA酶鏈組成，其中底物鏈與DNA酶鏈的比例應(yīng)嚴(yán)格控制在≤1，而這樣限制了催化信標(biāo)在信號(hào)放大檢測(cè)中的應(yīng)用。另外，這種催化信標(biāo)熒光猝滅效率較低，因此具有較高的熒光背景。在第4章中，基于具有特殊莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標(biāo)和與之具有相同配對(duì)堿基的雙鏈DNA之間熔鏈溫度的差異，我們提出了一種利用分子信標(biāo)作為底物鏈，從而避免對(duì)DNA酶修飾且能進(jìn)行多重循環(huán)信號(hào)放大的新型熒光催化信標(biāo)。而且該新型催化信標(biāo)還可作為熒光放大基團(tuán)用手目標(biāo)DNA的檢測(cè)。其動(dòng)力學(xué)響

8、應(yīng)范圍為0.5 nM～300 nM，檢測(cè)下限為200 pM。
　　 為了進(jìn)一步拓寬DNA酶的應(yīng)用范圍，在第5章中，我們基于DNA酶拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的改變可引起其催化活性的改變構(gòu)建了一個(gè)通用的放大傳感平臺(tái)用于檢測(cè)DNA序列和酶的活性。由于8-17 DNAzyme的部分序列被固定于探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，故酶的催化活性被抑制。當(dāng)存在目標(biāo)物（DNA或甲基化酶）時(shí)，目標(biāo)物和探針作用使其發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，8-17 DNA酶從發(fā)夾結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)且催化活性被

9、激活。具有催化活性的8-17 DNA酶可與發(fā)夾型的分子信標(biāo)底物雜交形成催化分子信標(biāo)傳感體系。加入鋅離子后，DNA酶催化切割分子信標(biāo)底物，使底物鏈片段從酶鏈上游離下來(lái)，熒光明顯增強(qiáng)。最后游離出來(lái)的8-17 DNA酶的酶鏈可重新與分子信標(biāo)底物雜交，引發(fā)下一輪的催化切割，如此循環(huán)，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的放大檢測(cè)。此外，我們還利用小分子末端保護(hù)策略和DNA酶的信號(hào)放大功能實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的放大檢測(cè)。當(dāng)不存在鏈霉親和素(SA)時(shí)，DNA探針被核酸外切酶Ⅰ(E

10、xoⅠ)切割為單堿基核苷酸，故不能催化切割分子信標(biāo)底物，因此傳感器的背景熒光很低。當(dāng)存在SA時(shí)，探針上標(biāo)記的生物素和SA結(jié)合從而阻止了ExoI切割DNA探針。最后包含8-17 DNA酶序列的DNA探針可以催化切割分子信標(biāo)底物并引起傳感體系熒光信號(hào)的增強(qiáng)。
　　 (2)在第6章中，我們將氧化石墨烯高的熒光猝滅率與核酸外切酶Ⅲ信號(hào)放大功能結(jié)合構(gòu)建了一種高靈敏、快速、單標(biāo)記的DNA熒光傳感器。標(biāo)記有熒光素(FAM)的DNA探針以單鏈形

11、式存在故不能被核酸外切酶Ⅲ切割，因此它可以通過(guò)π-π堆積作用吸附于GO表面并且熒光被猝滅。當(dāng)目標(biāo)DNA和探針鏈雜交后，核酸外切酶Ⅲ沿3'→5'方向?qū)⑻结樻溓懈畛蓧A基碎片，從而目標(biāo)DNA被釋放出來(lái)。釋放出的目標(biāo)DNA可繼續(xù)和其它DNA探針雜交同時(shí)誘發(fā)第二次酶切循環(huán)反應(yīng)。當(dāng)酶切反應(yīng)結(jié)束后加入適量的GO，由于DNA探針被切碎，故FAM遠(yuǎn)離GO而使其熒光不被猝滅。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)下限為20 pM。
　

12、　 (3)在第7章中，我們利用苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物作為熒光信號(hào)的報(bào)告分子，富G核苷酸序列作為鉛離子的識(shí)別探針構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、快速和無(wú)標(biāo)記的熒光增強(qiáng)型鉛離子傳感器。帶正電荷的苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物和帶負(fù)電荷的DNA探針之間強(qiáng)的靜電吸附作用導(dǎo)致苝二酰亞胺陽(yáng)離子化合物吸附在DNA探針上并使其熒光被猝滅。當(dāng)加入鉛離子后，DNA探針從單鏈狀態(tài)折疊成穩(wěn)定的G四股螺旋結(jié)構(gòu)。此時(shí)，花二酰亞胺陽(yáng)離子化合物與G四股螺旋結(jié)構(gòu)的吸附力遠(yuǎn)低于它與單鏈DNA的