類彈性蛋白用于修飾5-羥甲基糠醛氧化酶的研究.pdf

1、5-羥甲基糠醛氧化酶(5-Hydroxymethylfurfural oxidase，HMFO)是葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶家族中用于氧化底物5-羥甲基糠醛的一種酶。該底物經(jīng)4步連續(xù)催化反應(yīng)后，可生成產(chǎn)物2，5-呋喃二甲酸。2，5-呋喃二甲酸可作為一種前體材料用于新型聚酯材料的生產(chǎn)，可有效減少石油資源的消耗，因此對(duì)環(huán)境的保護(hù)作出重要貢獻(xiàn)。類彈性蛋白(Elastin-like polypeptide，ELPn)是一段由纈氨酸-脯氨酸-甘

2、氨酸-X-甘氨酸(VPGXG)組成的重復(fù)序列，具有在高溫下發(fā)生可逆相變的特性，因而被用于蛋白質(zhì)研究的多個(gè)方面，如蛋白質(zhì)純化、固定及藥物蛋白靶向性的提高。
　　本課題從來(lái)源于Methylovorus sp.strain MP688中的HMFO基因片段出發(fā)，利用分子生物學(xué)方法分別構(gòu)建含有ELPn的兩種HMFO表達(dá)載體。在獲得表達(dá)菌后利用ELPn在高于相變溫度發(fā)生可逆相變的特性，分別獲得HMFO-ELP6和HMFO-ELP10兩種融合蛋

3、白。根據(jù)對(duì)HMFO-ELPn及HMFO的溶解率測(cè)定可知，ELP作為融合標(biāo)簽不僅可以解決單獨(dú)表達(dá)HMFO易形成包涵體的問(wèn)題，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HMFO-ELPn融合蛋白在反應(yīng)條件下的聚沉率較低，有利于催化反應(yīng)的進(jìn)行。隨后利用圓二色譜、熒光光譜分析ELPn對(duì)HMFO穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明融合蛋白中的ELPn不會(huì)影響HMFO的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，且有利于提高HMFO的穩(wěn)定性。最后將HMFO和HMFO-ELPn在25℃pH8.0的最優(yōu)條件下進(jìn)行催化反應(yīng)比較其催

4、化效果，得出HMFO-ELP6在反應(yīng)24 h后產(chǎn)物FDCA得率為HMFO的1.3倍。
　　連續(xù)催化反應(yīng)中的副產(chǎn)物H2O2會(huì)對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用并破壞酶的穩(wěn)定性，為去除該副產(chǎn)物，本課題引入過(guò)氧化氫酶(hydrogenperoxide enzyme，CAT)。該酶在反應(yīng)過(guò)程中消耗H2O2生成H2O和O2，消除H2O2對(duì)反應(yīng)不利因素并提供氧氣促進(jìn)反應(yīng)快速進(jìn)行。利用HMFO與CAT構(gòu)成雙酶催化體系，結(jié)果表明，引入CAT可有效提高反應(yīng)催化速率