東北淡水魚低溫特征腐敗菌分析及其群體信號分子檢測研究.pdf

1、群體感應現(xiàn)象是指細菌產生自誘導物或信號分子進入環(huán)境中，通過感知細菌群體密度，從而開啟特定基因的表達機制。革蘭氏陰性菌產生的最常見的信號分子為N-酰基-L-高絲氨酸內酯(N-acyl-L-homoserine lactones，AHLs)。在淡水魚腐敗菌中，AHLs能夠調節(jié)腐敗菌的濃度，并提高腐敗菌的腐敗能力，加速魚肉的腐敗過程。檢測腐敗菌的AHLs對研究魚肉腐敗有著重要的作用。
　　本文以魚肉腐敗過程中特征腐敗菌產AHLs的含量變

2、化為研究對象，應用PCR-DGGE技術從東北淡水魚中篩選出在低溫條件下魚肉到達腐敗點時的特征腐敗菌;通過熒光染色、流式測定及透射電鏡等方法確定AHLs能夠誘導肥大細胞產生特異性反應;通過海藻酸鈉和氧化石墨烯形成生物相容性材料成功構建傳感模型，將其與肥大細胞電化學傳感技術相結合對3種AHLs標品進行快速檢測，繪制標準曲線;同時模擬魚肉腐敗過程，對腐敗魚肉中的AHLs進行檢測。為淡水魚腐敗過程中AHLs檢測提供新的理論和依據(jù)，為AHLs的常

3、規(guī)檢測提供了一種新型的、精確的檢測方法。本文主要研究方法和結果如下:
　　1.以東北三種淡水魚—鳙魚、鯽魚和鯉魚為研究對象，應用PCR-DGGE技術研究4℃冷藏過程中淡水魚的菌群多樣性變化。對新鮮點和腐敗點的三種淡水魚進行總DNA提取，通過對16S rDNA的V3區(qū)PCR擴增產物進行DGGE指紋圖譜分析，并對圖譜中的優(yōu)勢條帶進行割膠測序。結果表明，三種淡水魚在貯藏期間條帶變化明顯。新鮮點時，淡水魚菌群以氣單胞菌屬、假單胞菌屬、黃桿

4、菌屬、希瓦氏菌屬、不動桿菌屬和乳球菌屬為主;腐敗點時，假單胞菌屬、腐敗希瓦氏菌屬、芽單胞菌屬為優(yōu)勢菌屬。
　　2.生長良好的肥大細胞經(jīng)3種不同的AHLs刺激，通過熒光觀察、流式測定及透射電鏡掃描細胞形態(tài)來初步判定AHLs對肥大細胞的影響。熒光觀察結果表明，3種AHLs都一定程度上對肥大細胞有著調節(jié)作用，表現(xiàn)為細胞凋亡;流式細胞儀測定結果顯示，3中AHLs對肥大細胞的凋亡率在17～20％左右，其中3OC12-HSL效果最強;透射電鏡

5、圖像也證明了3種AHLs能使肥大細胞脫顆粒，使細胞核消融。
　　3.同時制備氧化石墨烯，將其與海藻酸鈉混合，優(yōu)化比例制成凝膠，通過FT-IR和XRD檢測兩者的相容性，并將肥大細胞固定在凝膠中，建立肥大細胞傳感模型。以RBL-2H3肥大細胞作為傳感介質，利用海藻酸鈉與氧化石墨烯混合制成的凝膠將肥大細胞固定于金電極表面，用該肥大細胞傳感器對不同細胞數(shù)的細胞進行檢測，選取最優(yōu)細胞數(shù)，然后對3種AHLs的標準物的不同濃度進行了檢測，以電化

6、學阻抗作為指標，建立了阻抗值與AHLs濃度之間的線性關系。經(jīng)FT-IR和XRD檢測，比例優(yōu)化后的氧化石墨烯和海藻酸鈉相容性很好，肥大細胞被成功的固定在凝膠中。通過電化學傳感優(yōu)化出凝膠中GO的最佳比例為10％，此時凝膠具有良好的導電性和塑性。通過電化學傳感器發(fā)現(xiàn)不同的細胞數(shù)與所測得的阻抗值有著線性關系，其線性方程為y=309.636x+354.711，R2=0.994。肥大細胞經(jīng)不同濃度的3OC12-HSL刺激后，隨著3OC12-HSL濃

7、度越大，所測得的阻抗值越小，且兩者在一定濃度范圍內成線性關系，其線性方程為y=-1339.252x+3580.906R2=0.994。而經(jīng)不同濃度的C4-HSL和C6-HSL刺激后，C4-HS和C6-HSL濃度越大，所測得阻抗值越小，兩者無線性關系。
　　4.選取假單胞菌和腐敗希瓦氏菌這兩株具有代表性的特征腐敗菌，分別接入無菌魚汁中，在不同時間進行AHLs的粗提取，經(jīng)過肥大細胞電化學傳感器測定后發(fā)現(xiàn)，在0～6天內兩種菌產生的AHL