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1、卵黃原蛋白(Vitellogenin,VTG)是檢測(cè)水環(huán)境雌激素的重要生物標(biāo)志物。雄性魚類VTG mRNA是一種檢測(cè)環(huán)境雌激素的新興生物標(biāo)志物。我國(guó)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)主要采用傳統(tǒng)的群落學(xué)方法和生物化學(xué)檢測(cè),應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)水環(huán)境雌激素的報(bào)道較少。久效磷(Monocrotophos,MCP)是一種常用的有機(jī)磷農(nóng)藥,已經(jīng)在我國(guó)造成了嚴(yán)重的農(nóng)藥殘留污染。本文選用在我國(guó)廣泛分布的魚類——金魚作為模式生物,研究久效磷對(duì)雄性金魚VTG mRNA表
2、達(dá)的影響。 實(shí)驗(yàn)室邴欣等已成功分離純化17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)暴露的雄性金魚血清VTG:用非變性聚丙烯酰胺電泳(PAGE)測(cè)得VTG的分子量約為440kDa;用Western-blot技術(shù)證明在0.01 mg·L-1、0.10 mg·L-1、1.00mg·L-1三個(gè)久效磷濃度暴露組都能夠誘導(dǎo)雄性金魚分泌VTG?;趯?shí)驗(yàn)室已經(jīng)完成的工作,本文采用RT-PCR檢測(cè)金魚VTG mRNA的表達(dá),克隆編碼金魚V
3、TG蛋白的部分cDNA片段,并以此為模板制備地高辛標(biāo)記的RNA探針,用這種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)環(huán)境雌激素對(duì)金魚的雌激素效應(yīng),建立了新的篩選環(huán)境雌激素的分子生物學(xué)方法。 實(shí)驗(yàn)所用金魚購(gòu)自青島南山花鳥市場(chǎng),馴養(yǎng)兩周后開始實(shí)驗(yàn)。取雌魚肝臟提取總RNA,根據(jù)已知氨基酸序列的魚種設(shè)計(jì)兼并引物,RT-PCR擴(kuò)增金魚VTG基因片段,得到一條1135bp的特異性條帶。將所得DNA進(jìn)行測(cè)序,其序列用NCBI的Blast進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示,擴(kuò)增所得
4、片段與鯉魚(Cyprinus carpio)的同源性為94%,與金魚(Carassius auratus)同源性為93%,與鰷魚(Pimephales promelas)同源性為90%,并且在系統(tǒng)發(fā)生樹中與金魚最為接近,由此可以初步認(rèn)為這段序列是編碼金魚VTG的基因序列。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證這段序列就是編碼金魚VTG的基因序列,同時(shí)建立檢測(cè)環(huán)境雌激素的新方法,將所得片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行增殖,提取質(zhì)粒,內(nèi)切酶SphI將質(zhì)粒線性化,純
5、化得到高純的線性DNA。選取Sp6 RNA聚合酶,以DNA為模板合成DIG標(biāo)記的cRNA探針。用所得探針(615bp)進(jìn)行Northern雜交實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,0.01 mg L-1、0.10 mg L-1和1.00 mg L-1三個(gè)久效磷濃度組表達(dá)了與每條魚0.2μg的17-β雌二醇暴露的金魚相同大小的VTG mRNA。證明魚類在久效磷誘導(dǎo)下能夠產(chǎn)生與內(nèi)源雌激素刺激下相同的VTG基因,進(jìn)一步驗(yàn)證了久效磷是一種環(huán)境雌激素。本實(shí)驗(yàn)建立了RT
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